2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  三氧化二砷(ATO),是砒霜的重要組成成分,在中國已經被使用了兩千多年。20世紀70年代 ATO被我國學者首先用于治療復發(fā)性和難治性急性早幼粒細胞性白血病( APL)。ATO是一個經典的細胞凋亡誘導劑,雖然在在急性早幼粒細胞白血病治療中療效顯著,但ATO在淋巴瘤中的治療作用仍然是有限的,這可能與淋巴瘤不恰當?shù)男盘柾返募せ罴暗蛲瞿褪苡嘘P,如信號轉導和轉錄因子3(STAT3)及抗凋亡蛋白Bcl-2高表達等。以前的研究表明

2、葫蘆素B(CucurbitacinB, CuB)是一種有效的 STAT3抑制劑,在多種腫瘤中展現(xiàn)出強大的抗腫瘤效應。Huang等研究顯示STAT3的激活與彌漫大B淋巴瘤的預后不良密切相關。因此我們猜想,葫蘆素可以通過抑制STAT3磷酸化增強ATO在淋巴瘤中的作用,改善淋巴瘤的凋亡耐受。ATO和CuB的合用在淋巴瘤中至今還未被嘗試過。
  結合相關研究背景和現(xiàn)狀,我們決定探索中藥栝樓對淋巴瘤細胞的作用,并探索其有效成分是否為CuB,

3、同時探索CuB是否可以在體內外協(xié)同增強ATO的抗淋巴瘤作用。最后進一步研究CuB聯(lián)合ATO抑制淋巴瘤的作用機制是否為CuB抑制了STAT3磷酸化。
  材料與方法:
  1.栝樓粗提物(TKE)對Burkitt’s淋巴瘤Ramos細胞增殖,凋亡和周期的影響:培養(yǎng)Burkitt淋巴瘤細胞株Ramos細胞和乳腺癌細胞MCF-7細胞,分別加入不同濃度梯度的TKE培養(yǎng)48h,臺盼藍拒染實驗觀察不同濃度的TKE對兩種細胞增殖的影響;設

4、置不同濃度的TKE劑量組(2.5ug/ml TKE,5ug/ml TKE和空白對照組),F(xiàn)CM檢測Ramos細胞在0h,12h,24h的凋亡情況;FCM檢測Ramos細胞周期阻滯情況。
  2.使用高效液相色譜指紋圖譜技術(HPLC)證實CuB是否為栝樓的有效成分。
  3. CuB對Ramos細胞增殖及凋亡,周期的影響:培養(yǎng)Ramos細胞,加入不同濃度的CuB,臺盼藍拒染實驗觀察細胞增殖;FCM檢測48h后的細胞凋亡率和周

5、期分布。
  4. CuB和ATO合用對淋巴瘤細胞增殖的影響:傳代培養(yǎng)Ramos、G519兩種淋巴瘤細胞。設不同濃度藥物CuB(1,2.5,5 nmol/L)和ATO(0.5,1,2μmol/L)單用及合用組劑量組,共培養(yǎng)24小時,MTS法檢測CuB聯(lián)合ATO對兩種細胞增殖的影響。
  5. CuB和ATO合用對淋巴瘤細胞凋亡的影響:傳代培養(yǎng)Ramos、G519兩種淋巴瘤細胞。每種細胞加入1 umol/L ATO和5 nmo

6、l/L CuB。FCM法檢測Ramos、G519兩種細胞的凋亡情況,Western blot檢測細胞凋亡蛋白酶caspase8,9,3的變化。
  6. CuB和ATO合用的抗腫瘤作用機制的研究:通過Western blot檢測了經CuB和 ATO單獨及聯(lián)合處理后,Ramos細胞內一些信號通路蛋白 P-STAT3、P-Erk1/2、bcl-2、Bax表達水平的變化。
  7. CuB和ATO合用的體內抗腫瘤作用研究:以Ram

7、os細胞注入裸鼠體內建立淋巴瘤裸鼠移植瘤模型。設空白對照組,CuB單藥組,ATO單藥組,CuB與ATO合用組,給藥20天后處死小鼠,計算抑瘤率。免疫組化檢測PCNA,STAT3的表達情況;TUNEL法檢測淋巴瘤細胞原位凋亡情況。
  結果:
  1.栝樓粗提物(TKE)對Burkitt’s淋巴瘤Ramos細胞增殖,凋亡,周期的影響
  TKE能以時間與劑量依賴性的方式抑制Ramos細胞增殖;TKE明顯誘導Ramos細胞

8、凋亡,在2.5μg/mL或5μg/mL TKE處理24 h后, TKE能以時間和劑量依賴性的方式誘導Ramos細胞凋亡;在24 h時,2.5和5μg/mL TKE組Ramos細胞的凋亡率的分別為33.93(±8.52)%,和71.33(±16.49)%(P<0.05)。通過凋亡檢測散點圖可以觀察到,在12 h和24 h之間,細胞呈現(xiàn)出一個明顯從早期凋亡到晚期凋亡的動態(tài)過渡。細胞周期結果顯示,TKE能誘導Ramos細胞組滯在G1期。

9、>  2. CuB:栝樓是活性成分之一
  通過分析,TKE在310 nm紫外線的保留時間是30.478s。高效液相色譜指紋圖譜顯示的CuB在310 nm的保留時間為30.395分鐘。因為保留時間的范圍的偏差在±2.5%,所以它可以證實,CuB是栝樓活性成分之一。
  3.CuB對Burkitt淋巴瘤Ramos細胞增殖,凋亡,周期的影響
  臺盼藍染色細胞計數(shù)結果顯示,2.5 nmol/ L和5 nmol/ L CuB

10、能呈時間和濃度依賴性地方式抑制Ramos細胞增殖。細胞凋亡檢測的結果顯示CuB對Ramos細胞有明顯的凋亡誘導作用。Ramos細胞的凋亡率在10 nmol/ L CuB處理后24 h高達64.4(±13.4)%(P<0.05)。細胞凋亡散點圖顯示24 h時,大量的細胞進入細胞晚期凋亡。在細胞周期檢測中,Ramos細胞經10 nmol/ L CuB處理后顯示出S期阻滯。
  4. CuB與ATO聯(lián)合應用的體外抗淋巴瘤作用
  

11、4.1.藥物聯(lián)合實驗果表明,低劑量的CuB與ATO聯(lián)合使用時,CuB能以協(xié)同地方式大大增強了ATO對Ramos細胞的增殖抑制作用,但沒有提高ATO對G519細胞的影響。
  4.2.細胞凋亡檢測顯示,聯(lián)合治療組(ATO+CuB)的細胞凋亡率高于CuB或ATO單獨作用。在G519細胞中,無明顯協(xié)同作用。Western blot結果顯示凋亡蛋白酶caspase8,9,3有明顯的裂解,表明CuB和ATO可同時通過內源性和外源性凋亡通路誘

12、導細胞凋亡。
  4.3.在聯(lián)合作用機制上,Western blot顯示,經CuB和ATO聯(lián)合處理后Ramos細胞內P-STAT3和P-Erk1/2水平下降,總STAT3和Erk沒有顯著改變。進一步檢測STAT3和Erk的下游靶標水平,發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白bcl-2表達下調,促凋亡蛋白Bax上調。
  5. CuB和ATO合用的體內抗腫瘤作用
  為了進一步證實葫蘆素與ATO合用的抗淋巴瘤作用,Ramos淋巴瘤移植瘤模型被建

13、立。設立生理鹽水(NS)組,CuB單藥組,ATO單藥作用,CuB與ATO合用藥組。經過20天腹腔給藥,結果顯示,CuB與ATO合用組瘤塊平均體積減小,小于對照組和 CuB和 ATO單用組。每組的平均瘤重為1.34±0.47g,1.20±0.69g,0.73±0.57g,0.25±0.22g,合用組抑瘤率達到85.6%。
  結論:
  1. CuB是栝樓的活性成分之一。
  2. CuB在Burkitt’s淋巴瘤中具有

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