阿霉素-血小板載藥體系的構(gòu)建及其抗淋巴瘤效應(yīng)的研究.pdf

1、目的：
　　以血小板為載體制備阿霉素-血小板載藥體系，研究其基本特性。觀察載藥后血小板形態(tài)、部分膜蛋白的表達(dá)及聚集功能的改變。觀察阿霉素搭乘血小板后對(duì)Raji細(xì)胞及Burkitt淋巴瘤裸鼠模型的作用，通過作用于新生裸鼠原代心肌細(xì)胞及Burkitt淋巴瘤裸鼠模型，考察心肌毒性。
　　方法：
　　(1)將全血離心、洗滌得到洗滌血小板(platelet)，與不同濃度的DOX充分混合反應(yīng)，通過2B分離柱分離后得到包載阿霉素的血

2、小板(DOX-platelet);
　　(2)高效液相色譜儀、電子秤計(jì)算載藥率(drug loading，DL)和包封率(encapsulationefficiency，EE)，熒光顯微鏡考察DOX是否被血小板包載，掃描電鏡(scanningelectron microscopy，SEM)觀察DOX包載于血小板后對(duì)血小板的形態(tài)有無影響，蛋白印跡(western blotting)法檢測(cè)血小板膜蛋白CD41、CD61及CD47的表達(dá)

3、，血小板聚集儀檢測(cè)血小板及包載阿霉素后血小板的聚集功能，體外透析實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DOX-platelet中DOX的釋放性能;
　　(3)Cell counting kit-8試劑盒檢測(cè)不同濃度DOX對(duì)Raji細(xì)胞增殖抑制作用，計(jì)算IC50值作為實(shí)驗(yàn)濃度，DOX-platelet組則根據(jù)載藥量計(jì)算，給予相當(dāng)于含等量DOX的DOX-platelet。將Platelet、DOX及DOX-platelet與Raji細(xì)胞株及新生裸鼠原代心肌細(xì)胞共培

4、養(yǎng)24h、48h、72h后計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率;
　　(4)流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率;
　　(5)共聚焦顯微鏡觀察各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)DAPI染色后細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變;
　　(6)FCM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DOX的藥物濃度。
　　(7)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶連反應(yīng)(reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法和western法

5、分別檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組Bad、Bcl-xl、Caspase9、P53的基因和蛋白表達(dá)水平;
　　(8)建立Burkitt淋巴瘤小鼠模型成功后將其分成Control、Platelet、DOX、DOX-platelet四個(gè)處理組，監(jiān)測(cè)各組裸鼠體重及瘤塊體積改變;
　　(9)HE染色觀察各處理組裸鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及腫瘤的組織病理學(xué)改變;
　　(10)RT-PCR法和western法分別檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組裸鼠瘤體Bad、Bc

6、l-xl、Caspase9、P53的基因和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　(1)DOX-platelet的表征
　?、?DOX可以被包載于血小板內(nèi)，且計(jì)算得DOX-platelet的載藥率為46.3％，包封率為86.6％;
　?、?DOX搭乘血小板后對(duì)血小板的形態(tài)無明顯影響，血小板和包載阿霉素后血小板的聚集功能及血小板膜蛋白CD41、CD47、CD61表達(dá)量均無明顯改變（P＞0.05）;Ⅲ.在pH為5.5的環(huán)境中

7、，36h內(nèi)DOX-platelet中DOX累積釋放率達(dá)到84.4％，而在pH=7.4及pH=8.4的環(huán)境中累積釋放率均小于40％。
　　(2)Raji細(xì)胞及新生裸鼠原代心肌細(xì)胞增殖抑制率:
　?、?DOX對(duì)Raji細(xì)胞增殖的抑制作用呈明顯的時(shí)間和濃度依賴性，且計(jì)算得24h的IC50為0.243ug/ml;
　?、?Platelet組與Control組比較，對(duì)Raji細(xì)胞及原代心肌細(xì)胞增殖抑制率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;

8、r>　　Ⅲ.作用Raji細(xì)胞24h、48h及72h后，DOX組對(duì)細(xì)胞增殖抑制率分別為(52.06±3.5)％、(61.90±4.0)％、(72.30±4.1)％，DOX-platelet組對(duì)細(xì)胞增殖抑制率為(65.80±3.0)％、(85.23±3.7)％、(90.60±3.4)％，兩組與空白對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且DOX-platelet組的作用更為顯著，與DOX組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（作用24h及48h的P＜0.05，作

9、用72h的P＜0.01）;
　　Ⅳ.DOX與DOX-platelet作用于原代心肌細(xì)胞24h、48h、72h，比較兩組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率后發(fā)現(xiàn)，DOX-platelet組可明顯減輕對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用(P＜0.01)。
　　(3)FCM檢測(cè)Raji細(xì)胞凋亡率及DAPI觀察Raji細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變:
　?、?作用Raji細(xì)胞24h后，Control、Platelet、DOX、DOX-platelet四組總凋亡率分別為（

10、5.9±0.52）％，（14.6±1.21）％，（50.5±5.01）％和（73.1±8.37）％，DOX及DOX-platelet組細(xì)胞凋亡較Control組均明顯增加(P＜0.01)，且DOX-platelet較DOX組增加更為明顯(P＜0.01);
　　Ⅱ.DOX及DOX-platelet兩組均可見到細(xì)胞凋亡的特征性改變，且在DOX-platelet組中可見到更多的凋亡小體及細(xì)胞碎片。
　　(4)FCM檢測(cè)Raji細(xì)胞

11、內(nèi)DOX濃度:
　　DOX及DOX-platelet組細(xì)胞內(nèi)DOX濃度較Control組均增加(P＜0.01)，且DOX-platelet與DOX比較增加更為顯著(P＜0.05)。
　　(5)RT-PCR及western Blot法分別檢測(cè)Bad、Bcl-xl、Caspase9和P53基因和蛋白表達(dá)水平:
　　DOX及DOX-platelet兩組與Control組比較，Bad、Caspase9和P53基因和蛋白表達(dá)水平

12、均明顯上調(diào)(P＜0.05)，Bcl-xl基因和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P＜0.05)，且DOX-platelet組的作用強(qiáng)于DOX組。
　　(6)各治療組裸鼠體重及腫瘤體積變化
　?、?DOX及DOX-platelet兩組裸鼠腫瘤體積較Control組明顯下降（P＜0.01），且DOX-platelet組較DOX組更為顯著(P＜0.01)。
　　Ⅱ.只有DOX組裸鼠體重較Control組顯著下降(P＜0.01)，Plat

13、elet組及DOX-platelet組與Control組相比無明顯差異(P＞0.05);
　　(7)HE染色觀察各處理組裸鼠組織病理學(xué)改變除DOX組的心肌細(xì)胞可見不同程度的壞死變性及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等，其余各組各組織均未見到明顯改變。
　　(8)RT-PCR法和western法檢測(cè)裸鼠腫瘤組織Bad、Bcl-xl、Caspase9和P53基因及蛋白表達(dá)水平
　　DOX及DOX-platelet兩組與Control組比較，B

14、ad、Caspase9和P53基因及蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)，Bcl-xl基因表達(dá)水平明顯下調(diào)，且DOX-platelet組的作用強(qiáng)于DOX組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　(1)血小板包載阿霉素后其形態(tài)、部分膜蛋白表達(dá)及聚集功能均無明顯改變;
　　(2)DOX-platelet可有效促進(jìn)DOX對(duì)Raji細(xì)胞增殖的抑制作用、減輕DOX對(duì)新生裸鼠原代心肌細(xì)胞的抑制作用，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞內(nèi)DOX藥物濃度，上調(diào)