天花粉蛋白抗小鼠B細(xì)胞淋巴瘤的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究天花粉蛋白(trichosanthin，TCS)對小鼠B細(xì)胞淋巴瘤A20同種移植模型腫瘤生長的抑制作用，并從細(xì)胞毒作用、免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤血管新生等方面進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。為進(jìn)一步探索TCS抗淋巴瘤的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用提供全面準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：首先構(gòu)建鼠源性B細(xì)胞淋巴瘤A20細(xì)胞株BALB/C小鼠荷瘤模型，隨機(jī)分為4組，10只/組，分別給予不同劑量的TCS（0.2，0.4和0.8mg/kg/d）或NS

2、(0.2mL/d)腹腔注射，持續(xù)7d。測量腫瘤體積、小鼠體重，觀察生存時(shí)間。
　　然后從細(xì)胞毒性、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤血管新生三個方面對TCS抗小鼠B細(xì)胞淋巴瘤的作用機(jī)制進(jìn)行探討。不同濃度的TCS(2.5，5，10，20，40μg/mL)作用于A20細(xì)胞24-72h，分別采用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry, FCM)檢測細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率和細(xì)胞周期，觀察TCS對A20細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。在上述體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，

3、通過ELISA檢測荷瘤小鼠TNF-α，IFN-γ和IL-2的血清水平，F(xiàn)CM檢測荷瘤小鼠脾臟中T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例，評估TCS對A20荷瘤小鼠免疫功能的影響。
　　在TCS抗腫瘤血管新生實(shí)驗(yàn)中，首先通過HE染色和CD31血管免疫熒光計(jì)算微血管密度(microvessel density, MVD)，然后通過ELISA檢測荷瘤小鼠MMP-2和MMP-9的血清水平，通過免疫組化測定腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)

4、。為了明確TCS抗血管新生的作用途徑，進(jìn)一步運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡(Western Blot)技術(shù)檢測不同濃度TCS對A20細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)蛋白和基因表達(dá)水平的影響。另外，將上述相應(yīng)濃度的TCS作用于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)24-72h，分別采用CCK-8、FCM檢測細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率和細(xì)胞周期，觀察TCS對HUVECs生物學(xué)活性的影響。進(jìn)

5、一步通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度的TCS(0，1.5，3，6μg/mL)對HUVECs遷移能力和侵襲能力的影響。最后，利用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TCS體內(nèi)抗血管新生的作用。
　　結(jié)果：1.TCS抑制A20荷瘤小鼠移植瘤的生長
　　TCS高、中劑量組小鼠的移植瘤體積分別為367±31.6mm3、516±39.3mm3，較對照組(1215±98.91mm3)和低劑量組(1005±81.56mm3

6、)顯著減低(P＜0.05); TCS高、中劑量組的瘤重分別為0.366±0.08g、0.968±0.26g，明顯低于對照組(2.43±0.62g)和低劑量組(1.55±0.17g)(P＜0.05);高、中、低三個治療組的抑瘤率分別為60.1％、46.2％和21.2％。高、中劑量TCS組荷瘤小鼠的中位生存時(shí)間分別為42±5d、34±3d，與低劑量組(25±2d)和對照組(24±2d)相比明顯延長（P＜0.05或P＜0.01）。
　　

7、2.TCS對A20細(xì)胞無直接細(xì)胞毒作用，對荷瘤小鼠的免疫功能無明顯影響
　　體外實(shí)驗(yàn)研究表明，TCS在對A20細(xì)胞的增殖活性沒有明顯抑制作用(P＞0.05)，對A20細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期無顯著影響（P＞0.05）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，TCS對荷瘤小鼠TNF-α、IL-2和IFN-γ的血清水平無明顯影響(P＞0.05)，對荷瘤小鼠脾臟中T淋巴細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例均無顯著影響（P＞0.05）。
　　3.TCS能

8、夠抑制淋巴瘤血管新生
　　HE染色后對照組和低、中、高劑量TCS組小鼠淋巴瘤組織的MVD分別為31±7、24±5、12±4和9±3 Vessels/HPF;免疫熒光檢測四個組的MVD分別為38±4、32±3、13±3和10±2Vessels/HPF。方差分析表明，TCS中、高劑量組的MVD明顯低于對照組和低劑量組(P＜0.05或P＜0.01)。免疫組化結(jié)果表明，中、高劑量TCS能夠降低小鼠腫瘤組織中VEGF的表達(dá)(P＜0.05)。

9、
　　對照組荷瘤小鼠血清中MMP-2和MMP-9的含量分別為83.56±16.35ng/mL和27.76±7.8ng/mL，低劑量組小鼠血清MMP-2水平為67.58±11.04ng/mL，MMP-9為21.84±7.23ng/mL;與上述兩組相比，高劑量組(MMP-2:27.22±4.38ng/mL，MMP-9:7.58±2.08ng/mL)和中劑量組(MMP-2:41.28±7.04ng/mL，MMP-9:14.02±3.39

10、ng/mL)荷瘤小鼠的MMP-2和MMP-9水平明顯降低(P＜0.05)。
　　4.TCS抑制HUVECs的生物學(xué)活性及運(yùn)動能力
　　TCS可抑制HUVECs的增殖活性，并存在濃度和時(shí)間依賴性，24，48和72h的IC50分別為27.39±0.8，14.04±0.03和5.9±0.2μg/mL;5，10和15μg/mL濃度的TCS作用48后，HUVECs的早期/晚期凋亡率分別達(dá)到(17.1±2.6)％，(32.6±3.6)％

11、和(52.1±5.3)％，G0/G1期細(xì)胞的比例分別是（73.5±4.89）％，（74.2±4.2）％和（76.8±4.32）％，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。
　　與對照組相比，TCS在1.5，3和6μg/mL的濃度下作用24h，HUVECs劃痕的直徑分別增加(26.5±5.9)％，(35.7±5.1)％和(66.2±7.3)％，作用48h劃痕的直徑分別增加(21.5±9.5)％，(68.1±

12、7.3)％和(173.5±20.5)％。TCS在上述濃度范圍內(nèi)作用24h，HUVECs的侵襲能力分別下降至(63.65±2.53)％，(56.18±2.62)％和(42.43±3.04)％，與對照組的差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　結(jié)論：TCS能夠抑制小鼠B細(xì)胞淋巴瘤A20在同種移植模型體內(nèi)的生長，能夠延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間。在TCS抗小鼠B細(xì)胞淋巴瘤的作用機(jī)制探討過程中發(fā)現(xiàn)，TCS對體外培養(yǎng)的A20淋巴瘤

13、細(xì)胞沒有直接的細(xì)胞毒作用，對A20荷瘤小鼠的免疫功能也沒有明顯的影響，其主要的作用機(jī)制在于抑制淋巴瘤的血管新生。進(jìn)一步的研究表明，TCS抗淋巴瘤血管新生的途徑主要包括:1.抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞A20細(xì)胞株VEGF、bFGF蛋白的表達(dá)和VEGFmRNA、bFGF mRNA的轉(zhuǎn)錄;2.降低細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境中MMP-2和MMP-9的水平;3.中制HUVECs的增殖，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)其凋亡，并抑制其遷移和侵襲等運(yùn)動能力。
　　意義：本研究首