天花粉蛋白抗小鼠B細(xì)胞淋巴瘤的作用及機(jī)制研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:研究天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)對(duì)小鼠B細(xì)胞淋巴瘤A20同種移植模型腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用,并從細(xì)胞毒作用、免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤血管新生等方面進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。為進(jìn)一步探索TCS抗淋巴瘤的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用提供全面準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
  方法:首先構(gòu)建鼠源性B細(xì)胞淋巴瘤A20細(xì)胞株BALB/C小鼠荷瘤模型,隨機(jī)分為4組,10只/組,分別給予不同劑量的TCS(0.2,0.4和0.8mg/kg/d)或NS

2、(0.2mL/d)腹腔注射,持續(xù)7d。測(cè)量腫瘤體積、小鼠體重,觀(guān)察生存時(shí)間。
  然后從細(xì)胞毒性、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤血管新生三個(gè)方面對(duì)TCS抗小鼠B細(xì)胞淋巴瘤的作用機(jī)制進(jìn)行探討。不同濃度的TCS(2.5,5,10,20,40μg/mL)作用于A(yíng)20細(xì)胞24-72h,分別采用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry, FCM)檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率和細(xì)胞周期,觀(guān)察TCS對(duì)A20細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。在上述體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,

3、通過(guò)ELISA檢測(cè)荷瘤小鼠TNF-α,IFN-γ和IL-2的血清水平,F(xiàn)CM檢測(cè)荷瘤小鼠脾臟中T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例,評(píng)估TCS對(duì)A20荷瘤小鼠免疫功能的影響。
  在TCS抗腫瘤血管新生實(shí)驗(yàn)中,首先通過(guò)HE染色和CD31血管免疫熒光計(jì)算微血管密度(microvessel density, MVD),然后通過(guò)ELISA檢測(cè)荷瘤小鼠MMP-2和MMP-9的血清水平,通過(guò)免疫組化測(cè)定腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)

4、。為了明確TCS抗血管新生的作用途徑,進(jìn)一步運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡(Western Blot)技術(shù)檢測(cè)不同濃度TCS對(duì)A20細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)蛋白和基因表達(dá)水平的影響。另外,將上述相應(yīng)濃度的TCS作用于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)24-72h,分別采用CCK-8、FCM檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率和細(xì)胞周期,觀(guān)察TCS對(duì)HUVECs生物學(xué)活性的影響。進(jìn)

5、一步通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀(guān)察不同濃度的TCS(0,1.5,3,6μg/mL)對(duì)HUVECs遷移能力和侵襲能力的影響。最后,利用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TCS體內(nèi)抗血管新生的作用。
  結(jié)果:1.TCS抑制A20荷瘤小鼠移植瘤的生長(zhǎng)
  TCS高、中劑量組小鼠的移植瘤體積分別為367±31.6mm3、516±39.3mm3,較對(duì)照組(1215±98.91mm3)和低劑量組(1005±81.56mm3

6、)顯著減低(P<0.05); TCS高、中劑量組的瘤重分別為0.366±0.08g、0.968±0.26g,明顯低于對(duì)照組(2.43±0.62g)和低劑量組(1.55±0.17g)(P<0.05);高、中、低三個(gè)治療組的抑瘤率分別為60.1%、46.2%和21.2%。高、中劑量TCS組荷瘤小鼠的中位生存時(shí)間分別為42±5d、34±3d,與低劑量組(25±2d)和對(duì)照組(24±2d)相比明顯延長(zhǎng)(P<0.05或P<0.01)。
  

7、2.TCS對(duì)A20細(xì)胞無(wú)直接細(xì)胞毒作用,對(duì)荷瘤小鼠的免疫功能無(wú)明顯影響
  體外實(shí)驗(yàn)研究表明,TCS在對(duì)A20細(xì)胞的增殖活性沒(méi)有明顯抑制作用(P>0.05),對(duì)A20細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期無(wú)顯著影響(P>0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,TCS對(duì)荷瘤小鼠TNF-α、IL-2和IFN-γ的血清水平無(wú)明顯影響(P>0.05),對(duì)荷瘤小鼠脾臟中T淋巴細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例均無(wú)顯著影響(P>0.05)。
  3.TCS能

8、夠抑制淋巴瘤血管新生
  HE染色后對(duì)照組和低、中、高劑量TCS組小鼠淋巴瘤組織的MVD分別為31±7、24±5、12±4和9±3 Vessels/HPF;免疫熒光檢測(cè)四個(gè)組的MVD分別為38±4、32±3、13±3和10±2Vessels/HPF。方差分析表明,TCS中、高劑量組的MVD明顯低于對(duì)照組和低劑量組(P<0.05或P<0.01)。免疫組化結(jié)果表明,中、高劑量TCS能夠降低小鼠腫瘤組織中VEGF的表達(dá)(P<0.05)。

9、
  對(duì)照組荷瘤小鼠血清中MMP-2和MMP-9的含量分別為83.56±16.35ng/mL和27.76±7.8ng/mL,低劑量組小鼠血清MMP-2水平為67.58±11.04ng/mL,MMP-9為21.84±7.23ng/mL;與上述兩組相比,高劑量組(MMP-2:27.22±4.38ng/mL,MMP-9:7.58±2.08ng/mL)和中劑量組(MMP-2:41.28±7.04ng/mL,MMP-9:14.02±3.39

10、ng/mL)荷瘤小鼠的MMP-2和MMP-9水平明顯降低(P<0.05)。
  4.TCS抑制HUVECs的生物學(xué)活性及運(yùn)動(dòng)能力
  TCS可抑制HUVECs的增殖活性,并存在濃度和時(shí)間依賴(lài)性,24,48和72h的IC50分別為27.39±0.8,14.04±0.03和5.9±0.2μg/mL;5,10和15μg/mL濃度的TCS作用48后,HUVECs的早期/晚期凋亡率分別達(dá)到(17.1±2.6)%,(32.6±3.6)%

11、和(52.1±5.3)%,G0/G1期細(xì)胞的比例分別是(73.5±4.89)%,(74.2±4.2)%和(76.8±4.32)%,與對(duì)照組相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。
  與對(duì)照組相比,TCS在1.5,3和6μg/mL的濃度下作用24h,HUVECs劃痕的直徑分別增加(26.5±5.9)%,(35.7±5.1)%和(66.2±7.3)%,作用48h劃痕的直徑分別增加(21.5±9.5)%,(68.1±

12、7.3)%和(173.5±20.5)%。TCS在上述濃度范圍內(nèi)作用24h,HUVECs的侵襲能力分別下降至(63.65±2.53)%,(56.18±2.62)%和(42.43±3.04)%,與對(duì)照組的差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。
  結(jié)論:TCS能夠抑制小鼠B細(xì)胞淋巴瘤A20在同種移植模型體內(nèi)的生長(zhǎng),能夠延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間。在TCS抗小鼠B細(xì)胞淋巴瘤的作用機(jī)制探討過(guò)程中發(fā)現(xiàn),TCS對(duì)體外培養(yǎng)的A20淋巴瘤

13、細(xì)胞沒(méi)有直接的細(xì)胞毒作用,對(duì)A20荷瘤小鼠的免疫功能也沒(méi)有明顯的影響,其主要的作用機(jī)制在于抑制淋巴瘤的血管新生。進(jìn)一步的研究表明,TCS抗淋巴瘤血管新生的途徑主要包括:1.抑制小鼠淋巴瘤細(xì)胞A20細(xì)胞株VEGF、bFGF蛋白的表達(dá)和VEGFmRNA、bFGF mRNA的轉(zhuǎn)錄;2.降低細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境中MMP-2和MMP-9的水平;3.中制HUVECs的增殖,阻滯細(xì)胞周期,誘導(dǎo)其凋亡,并抑制其遷移和侵襲等運(yùn)動(dòng)能力。
  意義:本研究首

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