黑曲霉EIM-6聚半乳糖醛酸酶基因的克隆和表達(dá).pdf

1、聚半乳糖醛酸酶是果膠降解酶系中比較重要的一個組分，它在工業(yè)，農(nóng)業(yè)等的多個領(lǐng)域都有廣泛的用途。本實(shí)驗(yàn)以一株產(chǎn)果膠酶的黑曲霉EIM-6菌株為出發(fā)菌株，克隆到黑曲霉聚半乳糖醛酸酶基因并成功實(shí)現(xiàn)在畢赤酵母中的表達(dá)，然后開展了聚半乳糖醛酸酶增效研究。以提取的黑曲霉總基因組為模板，克隆聚半乳糖醛酸酶基因，Blast比對結(jié)果表明，聚半乳糖醛酸酶基因的保守性很高，基因內(nèi)部約200-250bp的位置為內(nèi)含子區(qū)域，成熟肽基因序列全長為1113bp，可以翻譯

2、成370個氨基酸，分子量為38kD。進(jìn)一步對聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列、氨基酸組成、疏水作用、空間結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行了分析和預(yù)測，各個家族的聚半乳糖醛酸酶具有非常保守的作用位點(diǎn)，而且它有明顯的信號肽可以實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。
　　 以克隆的聚半乳糖醛酸酶基因組基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)引物，利用多引物重疊延伸PCR的方法克隆得到成熟肽基因。分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a-pga和真核表達(dá)載體pPIC3.5K-pga，轉(zhuǎn)化相應(yīng)宿主大腸桿菌BL21和

3、巴斯德畢赤酵母GS115，誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果顯示表達(dá)的重組聚半乳糖醛酸酶蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中以無活性的包涵體形式存在著，且難以實(shí)現(xiàn)酶的復(fù)性。在畢赤酵母GS115中的表達(dá)則成功的分泌出了分子量大小約為38kD且有活性的聚半乳糖醛酸酶蛋白，初步測定酶活為560個單位。經(jīng)分析其最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH為4.0，與野生的酶特性一致。
　　 利用獲得的聚半乳糖醛酸酶基因重組菌株，進(jìn)一步開展聚半乳糖醛酸酶對整個果膠酶系其他組分的共發(fā)酵和增