冬棗(ziziphusjujubamill.)果實多聚半乳糖醛酸酶多克隆抗體制備及抑制劑篩選

1、河北農業(yè)大學碩士學位論文冬棗（Ziziphus jujuba Mill.）果實多聚半乳糖醛酸酶多克隆抗體制備及抑制劑篩選姓名：郭函子申請學位級別：碩士專業(yè)：果樹學指導教師：溫陟良;彭士琪2001.6.1摘 要多聚半乳糖醛酸酶( P o l y g a l a c t u r o n a s e ．E ．c ．3 ．2 ．1 ．1 5 ．簡稱P G ) 是一種催化果膠物質降解的細胞壁水解酶，它廣泛存在于二植物體的各個部分，具有促進器官脫落

2、、花藥開裂、花粉管伸長以及果實軟化的作用。有研究表明，在棗果實成熟軟化過程中，P G 起著主導作用。為了研究P G 在這一過程中的內在機制、實現利_ I } J 基因．1 程的手段控制果實軟化，本試驗以鮮食棗品種冬棗為材料，對P G 進行了純化、抗體制各以及部分性質測定。∞冬棗粗酶液用P E G 一2 0 0 0 0 濃縮，經C M - s e p h a r o s eC L6 B 陽離子交換柱( 1 ．6 e m ×4 0

3、 c m ) 層析分離，川乙酸鈉4 0 m M 一2 0 0 m M 進行梯度洗脫，收集活性組分，將活性部分用P E G 一2 0 0 0 0 濃縮，再過S e p h a d e xG 一7 5 ( L 0 c m×8 0 c m ) 凝膠牲過濾，用4 0 m M 的乙酸鈉緩沖液和1 m M 的D T T 洗脫，收集活性組分，將活性部分用P E G 一2 0 0 0 0 濃縮，得到了純化5 0 倍的P G 酶蛋向，經S D

4、S ．P A G E 得到一條蛋白譜帶。以純化的P G 酶蛋白為抗原，免疫日本大耳白大白兔，得到棗P G 蛋白的多克隆抗體，再經飽和硫酸銨沉淀得到純化的抗血清，W e s t e r nb l o t i n g 分析能與P G 發(fā)生特異性結合J 通過對各種抑制劑對酶活性影響的研究發(fā)現，二價金屬離子C a ”、M g ”、Z n ”、H 9 2 + 均能部分抑制酶活性，M n 2 + 和C u 2 + 能強烈促進酶活性，E D T A

5、可以促進酶活性，三價金屬離子F e ”對酶活性促進作用較強，而A P 卻可以強烈的抑制酶活性，N a + 和K + 在低濃度時對酶都有促進的作用，但在高濃度時有抑制作用；陰離子表面活性劑S D S 和非離子型表面活性劑T r i t o nx ．1 0 0 對酶活性有促進作j } j ，在1 ％濃度時相對酶活性分別是1 5 0 ％} n 1 4 4 ％：陽離子表面活性劑C T A B 抑制作用較強，在濃度0 ．1 ％時相對活性為7 0

6、％；巰基試劑2 - M E對酶活性具有較強的促進作用；植物生長調節(jié)物質2 ，4 - D 和I A A 均能夠抑制酶活性，而N A A 和乙烯促進酶活性，G A ，對酶活性無影響。經S D S —P A G E測得棗P G 蛋白的分子量是3 1 5 0 0 ，比其它果實中的P G 蛋白的分子量小；P G蛋白的p H 穩(wěn)定范圍是4 ．5 —8 ．0 ；最適離子強度范圍是0 ．0 4 m o l ／L 0 ．0 6m o l ／L ；P G