甘藍(lán)型油菜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PGIP9和PGIP15基因克隆及真核表達(dá).pdf

1、黑脛病病原菌感染油菜時(shí)，病原菌會(huì)分泌一系列的聚半乳糖醛酸酶(PGs)來(lái)降解植物的天然屏障——細(xì)胞壁，并誘導(dǎo)油菜產(chǎn)生一系列抗性基因來(lái)防御黑脛病病原菌。其中特異性蛋白聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPs)能非競(jìng)爭(zhēng)性的抑制病原菌的內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PGs)的活性，來(lái)抵御病原真菌的侵染，抑制病害的發(fā)生，從而增強(qiáng)植物的抗病性。所以PGIP是一個(gè)有效的抗真菌病害的蛋白，值得用于植物的抗病育種。但植物中直接分離純化該蛋白有產(chǎn)率低、工藝復(fù)雜

2、等弊端，因此希望通過(guò)本研究克隆出pgip基因，構(gòu)建出能夠產(chǎn)生PGIP蛋白的工程菌株。本文克隆2個(gè)甘藍(lán)型油菜的聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPs)相關(guān)基因，轉(zhuǎn)入畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)，并檢測(cè)黑脛病病原菌誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜產(chǎn)生的PGIP蛋白對(duì)病原菌分泌的PG是否有抑制作用，為提高油菜黑脛病的抗性具有重大意義。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1、接種黑脛病病原菌NM-1孢子懸浮液于甘藍(lán)型油菜—青雜5號(hào)子葉葉片，提取病斑周?chē)~片總RNA，擴(kuò)增獲得pgip

3、9和pgip15的CDS編碼序列，構(gòu)建克隆載體pMD-19-T-pgip9/15。
　　2、構(gòu)建真核表達(dá)載體pPICZαA-pgip9/15，轉(zhuǎn)入Pichia pastoris PAMD16宿主細(xì)胞中構(gòu)建工程菌株。SDS-PAGE及Western blot檢測(cè)，在36～37KDa處出現(xiàn)單一的融合蛋白條帶。
　　3、工程菌株誘導(dǎo)表達(dá)后，上清液中PGIP9和PGIP15蛋白含量分別為12.356μg/μL和11.976μg/μL