5-氮胞苷聯(lián)合丹參酮ⅡA誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞定向分化的研究.pdf

1、由于當(dāng)今社會人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的變化，心血管系統(tǒng)疾病如缺血性心臟病，心肌梗死，擴(kuò)張型心肌病，心臟衰竭等的發(fā)病也呈逐年上升趨勢，威脅著人類健康。目前心肌梗死等疾病主要依靠溶栓、抗心力衰竭以及抗心律失常等治療方法。對于擴(kuò)張型心肌病的治療則沒有特效藥物及方法，主要是針對心力衰竭等相關(guān)癥狀對癥治療?，F(xiàn)有的研究也證實(shí)，中醫(yī)藥治療心肌梗死等缺血性心臟病，在一定程度上緩解患者的臨床癥狀且副作用小，但是單純的中藥治療仍不能短時(shí)間內(nèi)補(bǔ)充受損的心

2、肌細(xì)胞，無法從根本達(dá)到治愈患者的目的。對于心血管系統(tǒng)疾病晚期的患者，心臟移植是唯一的有效治療手段。因此研究者和臨床工作者們?nèi)耘ふ沂挂呀?jīng)壞死的心肌組織及細(xì)胞修復(fù)或再生的新的治療方案，基于此，干細(xì)胞移植便成為了國內(nèi)外心血管系統(tǒng)疾病研究的熱點(diǎn)。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mensenchymal stem cells，BMSCs)是一種分化能力較強(qiáng)的細(xì)胞，且具有多向分化的潛能和較強(qiáng)的可塑性。在特定組織微環(huán)境作用下可以定向分化為

3、相應(yīng)組織所需的成熟細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等，也能分化為心肌細(xì)胞。目前大多數(shù)研究者采用的使BMSCs定向分化為心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)劑是5-氮胞苷（5-azacytidine，5-aza）。臨床上常用的治療心血管疾病的中藥作為誘導(dǎo)劑也逐漸成為人們關(guān)注的對象。丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA)是從中藥丹參中提取的有效成分。研究表明，丹參酮ⅡA在誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖和分化過程中顯示出巨大的潛力。
　　本研究探討5-氮胞苷聯(lián)合丹參酮Ⅱ

4、A對BMSCs定向分化為心肌細(xì)胞的影響。首先分離并采集SD大鼠四肢骨骨髓，培養(yǎng)BMSCs，取第2代細(xì)胞生長48h后分為以下四組進(jìn)行誘導(dǎo):(1)加入含丹參酮ⅡA（終濃度為500ng/ml）的培養(yǎng)基，3天后去除誘導(dǎo)使用的培養(yǎng)基，加入不含有丹參酮ⅡA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4W。(2)加入含5-氮胞苷（終濃度為250μ g/L）的培養(yǎng)基，3天以后去除誘導(dǎo)使用的培養(yǎng)基，加入不含有5-氮胞苷的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4W。(3)加入含丹參酮ⅡA和5-氮胞苷（終濃度分

5、別為500ng/ml和250μ g/L）的培養(yǎng)基，3天后去除誘導(dǎo)使用的培養(yǎng)基，加入不含有丹參酮ⅡA和5-氮胞苷的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4W。(4)對照組加入不含有誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)，3天以后換液。此后定期換液（1次/3天），每天觀察細(xì)胞，當(dāng)發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞融合達(dá)約90％的密度時(shí)用0.04％的EDTA和0.5％的胰酶(1∶1)消化，隨后以1∶2的密度接種傳代。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測結(jié)蛋白、橫紋肌肌動(dòng)蛋白(a-SCA-actin)和心肌特異性肌鈣蛋白

6、T(cTnT)的表達(dá)情況。免疫熒光雙標(biāo)染色技術(shù)檢測聯(lián)合誘導(dǎo)組a-SCA-actin、cTnT的表達(dá)。結(jié)果表明5-氮胞苷誘導(dǎo)組7d時(shí)細(xì)胞以梭形、多邊形為主，丹參酮ⅡA誘導(dǎo)組培養(yǎng)10d時(shí)細(xì)胞逐漸呈長梭形，排列緊密，方向一致。二者聯(lián)合誘導(dǎo)組加入誘導(dǎo)劑后28d的BMSCs呈長圓柱狀，排列更加緊密，方向一致。未加誘導(dǎo)劑的BMSCs則呈纖維細(xì)胞樣形態(tài)改變。免疫細(xì)胞化學(xué)觀察在各誘導(dǎo)組cTnT、desmin、a-SCA-actin均為陽性表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)呈

7、棕黃色，而對照組各標(biāo)記物呈弱陽性或陰性表達(dá)，誘導(dǎo)各組與對照組各標(biāo)記物的陽性表達(dá)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，聯(lián)合誘導(dǎo)組a-SCA-actin陽性表達(dá)為紅色，cTnT陽性表達(dá)為綠色，兩者重疊部位為黃色，呈現(xiàn)共表達(dá)。透射電鏡結(jié)果顯示，聯(lián)合誘導(dǎo)組細(xì)胞可見平行排列的肌絲并富含線粒體、糖原和核糖體以及豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
　　結(jié)果顯示:1.BMSCs可以通過TanshinoneⅡ A單獨(dú)誘導(dǎo)、5-aza單獨(dú)誘