地黃多糖對(duì)大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化影響的研究.pdf

1、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSCs)是從脂肪組織中分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞，是成體干細(xì)胞的一種。近年來(lái)大量研究證明ADMSCs與其它干細(xì)胞一樣既具有很強(qiáng)的自我更新能力，又具有多向分化的潛能。但由于ADMSCs來(lái)源充足、取材方便、給患者帶來(lái)的痛苦較小，同時(shí)又可以避免倫理學(xué)等問(wèn)題，所以ADMSCs逐漸成為干細(xì)胞治療領(lǐng)域的一個(gè)新的焦點(diǎn)。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，心血管疾病的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)成為威脅人類健康的主要疾病，特別是急性心肌梗死、心

2、梗后心衰等疾病具有很高的病死率和致殘率。這是因?yàn)槌墒煨募〖?xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，缺乏再生能力，所以一旦心肌細(xì)胞受到不可逆損傷時(shí)，心肌細(xì)胞數(shù)量減少，纖維瘢痕組織增生替代，最終發(fā)展成為心力衰竭。多年來(lái)臨床工作者不斷致力于心肌梗死后心肌保護(hù)和梗死后心衰預(yù)防及治療的研究。目前最有效的方法就是盡快實(shí)現(xiàn)心肌的再灌注，目的是保護(hù)和挽救存活的心肌細(xì)胞，從而保護(hù)心功能。再灌注療法確實(shí)能夠降低上述疾病的死亡率，但由于受到很多因素的影響，再灌注保護(hù)和挽救心肌細(xì)

3、胞的作用有限。ADMSCs由于具有多向分化潛能，成功誘導(dǎo)ADMSCs向心肌細(xì)胞方向分化，實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞的再生及替代，自然成了解決這個(gè)難題的新思路。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有大量研究發(fā)現(xiàn)，ADMSCs能夠成功分化為心肌細(xì)胞，甚至觀察到了自主跳動(dòng)心肌細(xì)胞的產(chǎn)生；在體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ADMSCs移植后具有減小心肌梗死面積，改善心功能的作用。這些研究發(fā)現(xiàn)極大的鼓舞了世界各地的科研工作者。但由于ADMSCs研究尚處于起始階段，在實(shí)際應(yīng)用中還有許多問(wèn)題需要進(jìn)一步

4、研究，比如怎樣增強(qiáng)ADMSCs在體外培養(yǎng)的增殖能力，從而既實(shí)現(xiàn)ADMSCs在體外大量擴(kuò)增，又不影響其分化能力；ADMSCs移植到體內(nèi)或梗死區(qū)后能否繼續(xù)存活，怎樣提高移植細(xì)胞在梗死區(qū)的存活率；如何提高ADMSCs向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率等。這些問(wèn)題的解決對(duì)ADMSCs盡快應(yīng)用到臨床具有十分重要的意義。地黃多糖是中藥地黃的主要有效成分，從地黃的根莖中提取。研究發(fā)現(xiàn)地黃多糖可以明顯促進(jìn)正常小鼠骨髓造血干細(xì)胞的增殖，對(duì)粒單系祖細(xì)胞和早、晚期紅系祖細(xì)胞

5、的增殖和分化亦有明顯促進(jìn)作用。地黃提取物還可以不同程度的對(duì)抗肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化，從而降低組織的過(guò)氧化脂質(zhì)水平，此外地黃多糖還具有增強(qiáng)免疫力、抗衰老、保護(hù)心、腦、腎臟和胃黏膜等多種生物學(xué)功能。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)博大精深，并且擁有豐富的中醫(yī)藥材。本實(shí)驗(yàn)用地黃多糖作用于ADMSCs，旨在將祖國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與ADMSCs研究相結(jié)合，探索新的研究思路，希望能夠給ADMSCs研究帶來(lái)新的突破，為ADMSCs早日應(yīng)用到臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的：①分離、培

6、養(yǎng)大鼠ADMSCs，觀察地黃多糖對(duì)ADMSCs在體外培養(yǎng)時(shí)增殖能力和生物學(xué)性狀的影響；②用H2O2作用于ADMSCs，模擬ADMSCs移植到心肌梗死區(qū)的損傷，觀察地黃多糖對(duì)H2O2損傷ADMSCs的保護(hù)作用；③觀察地黃多糖對(duì)ADMSCs在體外經(jīng)5-氮胞苷(5-aza)誘導(dǎo)后向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響。 內(nèi)容和方法：根據(jù)以上目的，本研究分成三個(gè)部分： 第一部分取體重約200g的Wistar雄性大鼠，在無(wú)菌條件下分離培養(yǎng)ADMS

7、Cs，對(duì)第3代細(xì)胞行免疫組織化學(xué)染色，鑒定其表面分子CD13、CD31、CD44、CD45、CD105等的表達(dá)。取第3代細(xì)胞用不同濃度地黃多糖干預(yù)，MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；消化計(jì)數(shù)法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞貼壁率；免疫組織化學(xué)染色鑒定其表面分子。 第二部分同樣方法獲取ADMSCs。取第3代ADMSCs，隨機(jī)分為6組，I：H2O2損傷組；A、B、C、D分別為H2O2損傷加地黃多糖各濃度作用組(1 mg/L、50 mg/L、100 m

8、g/L、200mg/L)；N：正常對(duì)照組，對(duì)應(yīng)于分組，加入不同濃度地黃多糖培養(yǎng)24h，加250umol/L過(guò)氧化氫(H2O2)作用2h，誘導(dǎo)ADMSCs損傷，然后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活情況，比色法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶(LDH)的水平。 第三部分同樣方法獲取ADMSCs．取第3代ADMSCs，采用濃度為10umol/L的5-氮胞苷誘導(dǎo)24小時(shí)，之后分為A、B兩組(A：對(duì)照組；B：濃度為200mg/L的地黃多糖干預(yù)組)繼續(xù)培

9、養(yǎng)4周，免疫組化染色法鑒定α-actin的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組ADMSCs向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。 結(jié)果：大鼠附睪處脂肪組織中舍有大量ADMSCs，呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)，免疫化學(xué)染色鑒定CD13、CD44，CD105陽(yáng)性，CD31、CD45陰性；第3代ADMSCs具有活躍的增殖能力，加不同濃度地黃多糖干預(yù)后，ADMSCs的生長(zhǎng)增殖能力均提高，而且呈濃度依賴性；ADMSCs接種后24小時(shí)貼壁率可達(dá)95％以上，地黃多糖對(duì)ADMSCs的貼

10、壁率無(wú)明顯影響；地黃多糖對(duì)ADMSCs表面分子表達(dá)無(wú)影響。 H2O2損傷組與正常對(duì)照組相比較，存活細(xì)胞顯著減少(P＜0.01)、LDH水平明顯增高(P＜0.01)。地黃多糖各濃度組與H2O2損傷組比較，存活細(xì)胞顯著增加(P＜0.01)，LDH水平明顯降低(P＜0.01)，而且呈濃度依賴性。 ADMSCs在體外經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)后能夠成功分化為心肌細(xì)胞，α-actin染色陽(yáng)性。200mg/L的地黃多糖干預(yù)組與對(duì)照組心肌細(xì)胞

11、的轉(zhuǎn)化率分別是57.89％和19.48％。兩組均未觀察到自主跳動(dòng)的心肌細(xì)胞。 結(jié)論： 1． Wistar大鼠脂肪組織中含有大量ADMSCs；地黃多糖可以促進(jìn)ADMSCs的生長(zhǎng)增殖，而且不影響ADMSCs的表型，地黃多糖是ADMSCs在體外培養(yǎng)擴(kuò)增的有利因素。 2．地黃多糖可以抑制H2O2引起的ADMSCs減少和細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH含量的升高，減輕H2O2對(duì)ADMSCs的損傷，對(duì)ADMSCs具有保護(hù)作用。