黃芪甲苷定向誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的研究.pdf

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，至2020年，非傳染性疾病將占我國死亡原因的79％，其中心血管病將占首位。心肌梗塞，心肌病，終末期心力衰竭等心血管疾病嚴(yán)重地威脅人類的健康，其根本原因是心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，功能性心肌細(xì)胞的減少，壞死心肌不能再生，只能通過瘢痕形成來替代，以至發(fā)生頑固心力衰竭乃至死亡，臨床中藥或西藥治療、介入治療和手術(shù)治療均不能代替壞死的心肌，而心臟移植由于手術(shù)復(fù)雜、供體困難和費(fèi)用高等原因，在臨床很難推廣。而細(xì)胞移植術(shù)則為該類心血管

2、疾病的治療提供了一種全新的治療策略，即應(yīng)用組織工程技術(shù)將干細(xì)胞移植到病損的心肌組織內(nèi)，使之轉(zhuǎn)化且替代原來的心肌細(xì)胞，重建心肌的結(jié)構(gòu)，使衰竭的心功能得到恢復(fù)，達(dá)到根治的目的。 近年的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓基質(zhì)中還存在另一類干細(xì)胞稱之為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，在一定的環(huán)境和刺激因子作用下可分化為多種組織細(xì)胞，在組織工程中，MSCs作為一種重要的種子細(xì)胞越來越引起人們的關(guān)注，將MSCs誘導(dǎo)分

3、化為心肌細(xì)胞移植治療心肌梗死，為中藥與干細(xì)胞結(jié)合治療心血管疾病提供新的理論依據(jù)。 1、理論研究 間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stern cells，MSCs)是中胚層來源的具有多向分化能力的干細(xì)胞，主要存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富，胎兒臍血中亦可分離得到。具有向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、干細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和造血支持間質(zhì)細(xì)胞等分化的能力。同所有的干細(xì)胞一樣，骨髓間充

4、質(zhì)干細(xì)胞也具有自我更新能力和多向分化潛能。它雖然僅占骨髓單核細(xì)胞的 0.001％～0.01％，但是卻具有驚人的增殖能力。國內(nèi)外學(xué)者在體外培養(yǎng)中將MSCs經(jīng)細(xì)胞傳代后用 5-氮胞苷 (5-azacytidine，5-aza)對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)分化，可見有心肌細(xì)胞樣超微結(jié)構(gòu)，有心肌特異性基因表達(dá)，并有持續(xù)的動(dòng)作電位，表明他們成功地誘導(dǎo)出心肌細(xì)胞。另有學(xué)者將MSCs直接注入自體心肌組織內(nèi)，發(fā)現(xiàn)有心肌樣細(xì)胞形成，具有肌鈣蛋白T和肌球蛋白重鏈染色陽性的

5、心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志，表明MSCs在體內(nèi)微環(huán)境條件下可以誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞。 近年來，有研究證明中藥能有效地誘導(dǎo) MSCs 分化為神經(jīng)元細(xì)胞和成骨細(xì)胞，并且誘導(dǎo)率高。前期研究表明黃芪甲苷能夠定向誘導(dǎo)MSCs分化為心肌樣細(xì)胞，免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)蛋白(Desmin)和心肌特異性抗體CTnI表達(dá)陽性，RT-PCR檢測(cè)α-MHC和β-MHC 表達(dá)陽性，且誘導(dǎo)率于 5-aza比較無差異。 為進(jìn)一步研究黃芪甲苷誘導(dǎo)MSCs分化機(jī)制及為

6、臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，探索中藥在干細(xì)胞領(lǐng)域應(yīng)用基礎(chǔ)的前景，為中醫(yī)藥治療心肌壞死提供理論依據(jù)，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究帶來新的切入點(diǎn)，本研究選用中藥黃芪單體黃芪甲苷對(duì)大鼠MSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)。用免疫組化檢測(cè)是否有心肌特異性蛋白抗體(cTnT)和神經(jīng)膠質(zhì)源纖維酸性蛋白抗體(GFAP)表達(dá)，證實(shí)AS可定向誘導(dǎo)出心肌樣細(xì)胞，并檢測(cè)細(xì)胞分化情況，探討中藥誘導(dǎo)機(jī)制；干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死，觀察大鼠心功能和大鼠心臟組織病理變化，探索中藥臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。

7、 2、實(shí)驗(yàn)研究一 目的：探討黃芪甲苷體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)定向分化為為心肌樣細(xì)胞的機(jī)制。 方法：純種7周SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄不限，體質(zhì)量200±10g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；通過密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法分離大鼠MSCs，體外擴(kuò)增、培養(yǎng)、用流式細(xì)胞儀鑒定MSCs并連續(xù)傳代至第八代，分組進(jìn)行體外誘導(dǎo)，AS組 (終末濃度為 250mg/L)、5-aza 組 (終末濃度為10μmol/L)

8、。MSCs 分別進(jìn)行 24h、48h、72h 誘導(dǎo)；并設(shè)空白對(duì)照組，僅用基本培養(yǎng)基 (IMDM)誘導(dǎo)。 誘導(dǎo)后更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液一次，并觀察細(xì)胞形態(tài)變化，連續(xù)4周，之后通過免疫組化SABC試劑盒檢測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)源纖維酸性蛋白抗體(GFAP)和心肌特異性肌鈣蛋白T (cTnT)。 結(jié)果：原代培養(yǎng)的MSCs，24h 后均已貼壁，3～4d 后細(xì)胞呈集落生長，其形態(tài)多變化為短梭形，可見核仁。傳代后第3d可見細(xì)胞

9、體積較原代細(xì)胞增大，大部分呈紡錘狀或纖維狀等多種形態(tài)，胞漿透明，胞核明顯。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢查MSCs 表面抗原，CD34表達(dá)為陰性，CD44表達(dá)為陽性。經(jīng)AS、5-aza 等誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)從原來的成纖維狀變?yōu)榕帕汹呌谳^為一致的長梭形，且體積增大，4周后，細(xì)胞周圍伸出較多長的突起，體積大小不等，呈梭形，有纖維樣結(jié)構(gòu)存在，并出現(xiàn)肌管。免疫組化鑒定：未經(jīng)誘導(dǎo)MSCs的空白對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn) GFAP、cTnT陽性細(xì)胞，已誘導(dǎo)MSCs 的藥物實(shí)驗(yàn)

10、組中cTnT免疫組化染色均可見陽性免疫復(fù)合物，同時(shí)可見GFAP表達(dá)陽性。 結(jié)論：大鼠骨髓MSCs體外在AS作用下可分化為心肌樣細(xì)胞，同時(shí)MSCs還可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，提示中藥誘導(dǎo)機(jī)制可能為多途徑、多靶點(diǎn)，豐富了中藥在干細(xì)胞領(lǐng)域的理論。 3．實(shí)驗(yàn)研究二 目的：探索干細(xì)胞移植治療心肌梗死的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)，觀察移植后大鼠心功能和心臟組織病理變化。 方法：純種SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各25只，體質(zhì)量220±lOg

11、，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。大鼠隨機(jī)分為3個(gè)組，正常組(n=10)、模型組(n=11)、干細(xì)胞組(n=10)，除正常組外，其余2組制備大鼠急性心肌梗塞模型。肉眼觀察梗塞區(qū)顏色變白，心電圖可見ST-T改變，證明心梗模型成功。模型組向梗塞部位下4點(diǎn)心肌內(nèi)各注射生理鹽水10μ ml，干細(xì)胞組向梗塞部位下4點(diǎn)心肌內(nèi)各注射培養(yǎng)至第 6代 MSCs10μ ml，密度 1×10<'6>個(gè)/1。逐層關(guān)胸，術(shù)后腹腔注射青霉素抗感染，飼養(yǎng)4周。4周

12、后，心臟彩超檢測(cè)大鼠心功能，N-BT 染色法檢測(cè)大鼠心梗面積，組織病理學(xué)檢測(cè)大鼠心臟病理結(jié)構(gòu)改變。 結(jié)果：N-BT染色結(jié)果，模型組心梗面積 25.20±31.97mm<'2>，干細(xì)胞組心梗面積為4.12±2.18mm<'2>，干細(xì)胞組同模型組比較 P<0.05，具有有顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。心臟彩超檢測(cè)各組大鼠 LVEDD、LVESD、EF、SV、CO 等結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞組同模型組的大鼠的 LVEDD、LNESD、EF、CO