白細(xì)胞介素22與33在大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng)中的作用.pdf

1、背景：角膜病在我國(guó)致盲的主要原因中位居第二，角膜移植是目前臨床上醫(yī)治角膜盲唯一、有效的復(fù)明手段。眼球是一個(gè)獨(dú)特的免疫器官:其自身具有免疫赦免及前房相關(guān)免疫偏離的免疫學(xué)特點(diǎn)，同時(shí)角膜組織中沒(méi)有血管及淋巴管，因此，角膜移植手術(shù)的成功率較其它組織器官明顯增高。
　　白細(xì)胞介素22（interleukin-22，IL-22）和白細(xì)胞介素33(interleukin-33，IL-33)分別屬于近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素10(IL-10)和白細(xì)胞

2、介素1（IL-1）家族新成員。IL-22通過(guò)與其受體復(fù)合物(IL-22R1-IL-10R2)結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶Jak1、Tyk2、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路(MEK-ERK-RSK、JNK/SAPK和p38激酶），廣泛參與調(diào)控機(jī)體多種疾?。ㄈ缏匝装Y、自身免疫性疾病、腫瘤和移植免疫反應(yīng)等）的免疫應(yīng)答過(guò)程。IL-33與其跨模型ST2受體(ST2L)相互作用，可誘導(dǎo)My

3、D88、IRAK1和IRAK4、TRAF6等分子聚集，進(jìn)一步激活胞內(nèi)核因子-κB(NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)（包括ERK1、ERK2、p38及JNK1）信號(hào)通路，參與機(jī)體免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)。除此之外，還可上調(diào)樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)表面MHCⅡ分子及共刺激分子CD86的表達(dá)，增強(qiáng)DCs的抗原提呈功能。
　　基于白細(xì)胞介素-22(IL-22)和白細(xì)胞介素-33(IL-33)這兩類(lèi)新型細(xì)胞因子在固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答過(guò)程中具

4、有重要免疫學(xué)效應(yīng)，目前它們?cè)跈C(jī)體多種疾?。ㄓ绕涫亲陨砻庖咝约膊?、過(guò)敏性疾病、感染及心血管疾?。┲械恼{(diào)節(jié)作用已得到廣泛研究，在器官移植免疫方面也引起了人們的重視。至今為止，國(guó)內(nèi)外關(guān)于IL-22、IL-33在角膜移植免疫排斥反應(yīng)中的作用還沒(méi)有相關(guān)的研究報(bào)告。
　　為此，本課題通過(guò)建立SD-Wistar大鼠間的穿透性角膜移植模型，以白細(xì)胞介素-22(IL-22)和白細(xì)胞介素-33(IL-33)這兩種新型細(xì)胞因子為研究對(duì)象，觀察角膜移植術(shù)

5、后不同時(shí)間點(diǎn)植片中IL-22、IL-33的表達(dá)變化，初步探討其在角膜移植術(shù)后免疫反應(yīng)中的潛在生物學(xué)效應(yīng)及其作用機(jī)制，為將來(lái)更有效地臨床預(yù)防和治療角膜移植免疫排斥反應(yīng)提供新的策略。
　　第一部分IL-22在大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng)中的作用探討
　　目的：探討IL-22在大鼠角膜組織中的表達(dá)及其在角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)中的作用。
　　方法：1.穿透性角膜移植模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組:分別取24只SD大鼠作為移植供體，72只W

6、istar大鼠作為受體，行同種異體間角膜穿透性移植術(shù)。實(shí)驗(yàn)將72只受體隨機(jī)分為三組:自體角膜移植組(B)、角膜移植排斥組(C)和角膜移植后典必殊治療組(D)，另取4只Wistar鼠共8只眼作正常對(duì)照（即正常對(duì)照組A）。D組術(shù)后每日滴典必殊眼液，每日2次，每次1滴，共用2周。
　　2.角膜植片的臨床觀察及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):角膜移植術(shù)后14天內(nèi)，每日在裂隙燈顯微鏡下觀察角膜植片的混濁程度、水腫程度及新生血管生長(zhǎng)情況;14天后，隔日觀察一次，觀

7、察期為30天。參照Larkin等的評(píng)分方法，對(duì)角膜混濁程度、水腫程度及新生血管情況進(jìn)行評(píng)估，角膜混濁程度分為0-4級(jí)（0:植片完全透明;1:植片輕度混濁;2:植片中度混濁，裂隙燈下虹膜血管可見(jiàn);3:虹膜血管窺不清，僅可見(jiàn)瞳孔輪廓;4:植片完全混濁，瞳孔輪廓窺不清）;角膜水腫程度分為0-2級(jí)（0:植片未發(fā)生水腫;1:植片出現(xiàn)中度水腫;2:植片明顯水腫，伴基質(zhì)層顯著增厚）;角膜新生血管分為0-4級(jí)（0:植片無(wú)新生血管形成;1:新生血管長(zhǎng)至植

8、片任一象限半徑的25％處;2:新生血管長(zhǎng)至植片任一象限半徑的50％處;3:新生血管長(zhǎng)至植片任一象限半徑的75％處;4:新生血管長(zhǎng)至植片中央?yún)^(qū)域）。上述3項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)分總和為當(dāng)日排斥反應(yīng)指數(shù)(RI)，如三項(xiàng)評(píng)分總和(RI)≧5分或者植片混濁度一項(xiàng)達(dá)到3分，則認(rèn)為角膜植片發(fā)生免疫排斥。
　　3.組織病理學(xué)檢測(cè):各組分別于術(shù)后第5、14天隨機(jī)抽取3只大鼠眼球，標(biāo)本取出后立即行4％多聚甲醛固定，固定完成后再經(jīng)不同濃度乙醇梯度脫水、石蠟包埋，

9、然后制備成5μm厚的連續(xù)切片，采用蘇木素-伊紅（HE）染色，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。
　　4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè):各組分別于角膜移植術(shù)后第5、14天隨機(jī)取5只角膜，并立即置于-80°冰箱保存。按取材時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增反應(yīng)，觀察角膜組織中IL-22mRNA和AhRmRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1.各組角膜植片的臨床觀察:角膜移植術(shù)后前3天，各組角膜植片均出現(xiàn)輕度水腫

10、、混濁，B、C組角膜緣處出現(xiàn)新生血管，D組角膜緣未見(jiàn)新生血管。B組和D組角膜植片水腫、混濁程度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐步減輕，而C組植片則進(jìn)行性加重直至徹底混濁，且伴隨植片增厚。另外，B組和C組角膜新生血管由植床向植片方向逐漸延伸，于術(shù)后第14天可達(dá)到植片中央，而D組新生血管僅局限于角膜緣。
　　2.各組角膜植片的存活時(shí)間(MST):C組角膜植片平均存活（10.13±0.44）d，D組平均存活（18.00±0.66）d，二者間具有顯著性差異(

11、P＜0.01)。
　　3.A組大鼠角膜上皮層由5～6層細(xì)胞所構(gòu)成，基質(zhì)層膠原纖維排列規(guī)則，無(wú)水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。C組角膜植片顯著水腫伴基質(zhì)層增厚，基質(zhì)層中膠原纖維結(jié)構(gòu)紊亂，炎性細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)，并可見(jiàn)新生血管管腔，術(shù)后第14d較5d更加明顯。而B(niǎo)組和D組角膜結(jié)構(gòu)基本正常，基質(zhì)層僅有少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　4.各組IL-22和AhRmRNA在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá):A、B組角膜植片內(nèi)均可見(jiàn)IL-22mRNA表達(dá)，C組IL-22mRNA

12、的表達(dá)水平顯著增加，而D組角膜IL-22mRNA的表達(dá)較C組明顯降低;另外，AhRmRNA有類(lèi)似表達(dá)趨勢(shì)。
　　結(jié)論：IL-22可能參與了大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生過(guò)程，而AhR參與IL-22的表達(dá)調(diào)控過(guò)程。
　　第二部分IL-33在大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng)中的作用
　　目的：探討IL-33在大鼠角膜組織中的表達(dá)以及對(duì)角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的影響。
　　方法：1.穿透性角膜移植模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組:取4只W

13、istar鼠（8只眼）作為正常對(duì)照組(A)，24只Wistar鼠作為自體角膜移植組(B)，另取24只SD鼠為供體和48只Wistar鼠為受體進(jìn)行同種異體間穿透性角膜移植(C、D)，D組術(shù)后每日滴典必殊眼液（2次/d），共2周。
　　2.角膜植片的臨床觀察及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):角膜移植術(shù)后14天內(nèi)，每日在裂隙燈顯微鏡下觀察角膜植片的混濁程度、水腫程度及新生血管生長(zhǎng)情況;14天后，隔日觀察一次，觀察期為30天。參照Larkin等的評(píng)分方法，對(duì)角

14、膜混濁程度、水腫程度及新生血管情況進(jìn)行評(píng)分，角膜混濁程度分為0-4級(jí)（0:植片完全透明;1:植片輕度混濁;2:植片中度混濁，裂隙燈下虹膜血管可見(jiàn);3:虹膜血管窺不清，僅可見(jiàn)瞳孔輪廓;4:植片完全混濁，瞳孔輪廓窺不清）;角膜水腫程度分為0-2級(jí)（0:植片未發(fā)生水腫;1:植片出現(xiàn)中度水腫;2:植片明顯水腫，伴基質(zhì)層顯著增厚）;角膜新生血管分為0-4級(jí)（0:植片無(wú)新生血管形成;1:新生血管長(zhǎng)至植片任一象限半徑的25％處;2:新生血管長(zhǎng)至植片任

15、一象限半徑的50％處;3:新生血管長(zhǎng)至植片任一象限半徑的75％處;4:新生血管長(zhǎng)至植片中央?yún)^(qū)域）。上述3項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)分總和為當(dāng)日排斥反應(yīng)指數(shù)（RI），如三項(xiàng)總和（RI）≧5分或者植片混濁度一項(xiàng)達(dá)到3分，則認(rèn)為角膜植片發(fā)生免疫排斥。
　　3.組織病理學(xué)觀察及免疫組織化學(xué)檢測(cè):各組分別于角膜移植術(shù)后第5、14天隨機(jī)取3只大鼠眼球行4％多聚甲醛固定，經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋，然后制備成5μm厚的連續(xù)切片，采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察角

16、膜組織病理學(xué)改變，并行免疫組織化學(xué)檢測(cè)角膜組織中ST2蛋白的表達(dá)水平，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。
　　結(jié)果：1.各組角膜植片的臨床觀察:角膜移植術(shù)后前3天，各組角膜植片均出現(xiàn)輕度水腫、混濁，B、C組角膜緣處出現(xiàn)新生血管，D組角膜緣未見(jiàn)新生血管。B組和D組角膜植片水腫、混濁程度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐步減輕，而C組植片則進(jìn)行性加重直至徹底混濁，且伴隨植片增厚。另外，B組和C組角膜新生血管由植床向植片方向逐漸延伸，于術(shù)后第14天可達(dá)到植片中央，而D

17、組新生血管僅局限于角膜緣。
　　2.各組角膜植片的存活時(shí)間(MST):C組角膜植片平均存活（10.13±0.44）d，D組平均存活（18.00±0.66）d，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，二者間具有顯著性差異(x2=16.442，P=0.000)。
　　3.A組大鼠角膜上皮層由5～6層細(xì)胞所構(gòu)成，基質(zhì)層膠原纖維排列有序，無(wú)水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。C組角膜植片顯著水腫伴基質(zhì)層增厚，基質(zhì)層中膠原纖維結(jié)構(gòu)紊亂，炎性細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)，并可見(jiàn)新生