草魚白細(xì)胞介素10的免疫調(diào)節(jié)功能及其作用機(jī)制研究.pdf

1、在哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)中，白細(xì)胞介素10（Interleukin-10，IL-10）被認(rèn)為是具有多重功能的重要細(xì)胞因子。IL-10由多種細(xì)胞分泌并作用于各種免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，調(diào)控這些細(xì)胞的生長(zhǎng)、成熟、增殖、分化與活化，進(jìn)而影響機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫，并與其它細(xì)胞因子一起維持了免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。
　　硬骨魚 IL-10在多種魚類包括斑馬魚、金魚、鯉魚和虹鱒中被克隆鑒定，但有關(guān)硬骨魚 IL-10的免

2、疫調(diào)節(jié)功能知之甚少，其受體和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，以及作用機(jī)制均有待闡明。本論文研究草魚 IL-10的免疫學(xué)功能，不僅揭示其保守的抑炎癥功能，而且闡明它和另一經(jīng)典抑炎癥細(xì)胞因子 TGF-β1參與免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的相互關(guān)系和作用機(jī)制，從而拓展了對(duì)魚類 IL-10免疫學(xué)地位的認(rèn)識(shí)。另外，為了解草魚IL-10發(fā)揮作用的分子機(jī)制，進(jìn)一步鑒定了草魚IL-10介導(dǎo)的IL-10受體1（IL-10R1）和IL-10受體2（IL-10R2）及其下游信號(hào)通路（ST

3、AT3）和靶基因細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控蛋白3（Suppressor of cytokine signaling3，SOCS3）。為獲悉草魚IL-10的產(chǎn)生機(jī)制，初步探討了LPS和IFN-γ對(duì)草魚IL-10的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.重組草魚IL-10蛋白的活性鑒定和參與的免疫刺激作用：（1）通過(guò)硬骨魚同源序列比對(duì)克隆獲得草魚IL-10 cDNA全長(zhǎng)序列，并用生物信息學(xué)方法分析其結(jié)構(gòu)域與保守特性。（2）實(shí)時(shí)熒光定量P

4、CR（qPCR）方法檢測(cè)草魚IL-10在各組織中的表達(dá)，結(jié)果表明草魚 IL-10主要在免疫相關(guān)組織頭腎、腎、鰓中有較高表達(dá)，提示草魚 IL-10可能參與免疫相關(guān)反應(yīng)。（3）構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)并采用親和純化法獲得高純度重組草魚IL-10蛋白，利用此蛋白研究草魚IL-10免疫學(xué)功能。（4）細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果表明草魚IL-10能夠促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞PBLs的細(xì)胞活性。相似地，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（Transforming growth factorβ

5、1，TGF-β1）也能促進(jìn)PBLs的細(xì)胞活性。（5）為揭示上述作用的機(jī)制，采用草魚IL-10免疫中和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)草魚TGF-β1是依賴于IL-10發(fā)揮上調(diào)PBLs細(xì)胞活性的作用。（6）上述結(jié)論得到進(jìn)一步支持，即qPCR和競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫吸附（CI-ELISA）實(shí)驗(yàn)表明草魚TGF-β1促進(jìn)IL-10的mRNA表達(dá)和蛋白分泌水平，從而證明TGF-β1可能通過(guò)誘導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生來(lái)上調(diào)PBLs的細(xì)胞活性。本章證明了重組草魚IL-10的免疫刺激作用

6、，特別是揭示了魚類TGF-β1和IL-10在發(fā)揮免疫刺激作用中的上下游關(guān)系。
　　2.草魚IL-10和TGF-β1在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中的作用和相互關(guān)系：（1）在草魚頭腎單核/巨噬細(xì)胞中，加入的草魚IL-10和TGF-β1均抑制LPS刺激促炎癥信號(hào)因子TNF-α、IL-1β、iNOS和IL-8的表達(dá)。（2）相反地，草魚IL-10和TGF-β1的抗體均放大LPS對(duì)上述促炎癥信號(hào)因子mRNA的上調(diào)作用，提示內(nèi)源的IL-10與 TGF-β1發(fā)

7、揮了抑制促炎癥因子表達(dá)的作用。（3）機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，草魚 IL-10與TGF-β1均能促進(jìn)草魚IκBα全蛋白的表達(dá),即抑制IκBα的降解從而抑制NF-κB通路的激活，表明草魚TGF-β1和IL-10可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路控制LPS誘導(dǎo)的促炎癥因子表達(dá)。（4）草魚IL-10抗體和TGF-β1抗體分別對(duì)TGF-β1和IL-10的調(diào)節(jié)作用不產(chǎn)生影響，提示在 LPS激活的頭腎單核/巨噬細(xì)胞中，TGF-β1與IL-10獨(dú)立發(fā)揮抑制功能。這些

8、結(jié)果驗(yàn)證了魚類IL-10的抑炎癥作用及其機(jī)制，以及與另一抑炎癥因子 TGF-β1平行發(fā)揮作用的關(guān)系，從而豐富了魚類炎癥反應(yīng)控制機(jī)制的知識(shí)。
　　3.草魚 IL-10受體及信號(hào)通路的鑒定：(1)采用同源克隆技術(shù)獲得了草魚IL-10受體1（IL-10R1）、細(xì)胞因子受體家族成員4（cytokine receptor family member4，CRFB4）以及細(xì)胞因子受體家族成員5（CRFB5），并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。（2）qPC

9、R檢測(cè)結(jié)果表明草魚IL-10R1表達(dá)于鰓、胸腺、脾、頭腎等免疫相關(guān)組織，而草魚CRFB4與CRFB5則廣泛表達(dá)于各檢測(cè)組織，展現(xiàn)出與哺乳動(dòng)物同系基因類似的表達(dá)特性。（3）構(gòu)建這三種受體的真核表達(dá)質(zhì)粒，在草魚腎細(xì)胞系CIK中，通過(guò)對(duì)STAT3控制的熒光素酶的活性檢測(cè)，證明了草魚IL-10R1在IL-10信號(hào)傳導(dǎo)中的必要地位，以及草魚IL-10能夠上調(diào)STAT3的活性。更重要的，首次證明了CRFB4而不是CRFB5作為草魚IL-10R2。（

10、4）分離克隆草魚SOCS3啟動(dòng)子區(qū)域，并構(gòu)建草魚SOCS3啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒及其STAT結(jié)合位點(diǎn)的突變體，熒光素酶的活性檢測(cè)表明草魚STAT3介導(dǎo)IL-10對(duì)SOCS3啟動(dòng)子活性的上調(diào)作用。（5）在原代細(xì)胞草魚頭腎白細(xì)胞HKLs中，免疫印跡和qPCR結(jié)果證明草魚IL-10激活STAT3信號(hào)通路并介導(dǎo)SOCS3 mRNA的表達(dá)。這些工作闡明了草魚IL-10調(diào)節(jié)靶基因SOCS3轉(zhuǎn)錄的IL-10R1/CRFB4/STAT3信號(hào)通路。

11、>　　4、草魚 IL-10的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析：（1）在草魚頭腎單核/巨噬細(xì)胞中，LPS通過(guò)MAPK/ERK和NF-κB信號(hào)通路上調(diào)IL-10 mRNA表達(dá)。（2）在草魚頭腎單核/巨噬細(xì)胞中，重組草魚 IFN-γ抑制 IL-10 mRNA的表達(dá)，參與的信號(hào)通路為MAPK/ERK。（3）LPS上調(diào)草魚IL-10啟動(dòng)子活性，而重組草魚IFN-γ抑制IL-10啟動(dòng)子的活性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同的刺激作用通過(guò)不同的信號(hào)途徑調(diào)控IL-10的表達(dá)。

12、r>　　本論文揭示了草魚 IL-10的免疫調(diào)節(jié)功能，包括刺激免疫細(xì)胞活性的新發(fā)現(xiàn)和在炎癥反應(yīng)中的經(jīng)典抑制功能，特別明確了兩種重要抑炎癥因子 IL-10與TGF-β1在上述調(diào)節(jié)作用中的相互關(guān)系和作用機(jī)制，鑒定了草魚IL-10的特異受體IL-10R1和輔助受體 CRFB4，闡明了草魚 IL-10激活 STAT3信號(hào)通路和靶基因SOCS3，且探討了不同誘導(dǎo)條件下 IL-10的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。本論文的結(jié)果不僅填補(bǔ)了硬骨魚 IL-10功能特性、相關(guān)