從分子、細(xì)胞和動(dòng)物水平研究鉛誘發(fā)氧化損傷及細(xì)胞凋亡的效應(yīng)與機(jī)理.pdf

1、隨著現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展，含鉛制品的種類和使用量越來越多，帶來的污染也越來越重。盡管各國(guó)政府已經(jīng)采取多項(xiàng)措施限制和減少鉛的使用，鉛污染引發(fā)的健康問題依舊非常突出，已經(jīng)成為當(dāng)前社會(huì)高度關(guān)注的環(huán)境與健康問題之一。鉛能夠通過水、空氣、食物鏈富集等途徑與人體和動(dòng)物體廣泛接觸，進(jìn)而通過消化道、呼吸道和皮膚等吸收進(jìn)入人體，經(jīng)血液循環(huán)系統(tǒng)分布到全身器官，引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)、肝、腎、大腦等多系統(tǒng)性、多器官性的機(jī)體損傷。
　　氧化應(yīng)激是所有疾病發(fā)生的誘因。

2、研究表明鉛類污染物對(duì)生命體的危害與氧化應(yīng)激效應(yīng)密切相關(guān)。鉛暴露使機(jī)體產(chǎn)生過量的活性氧物質(zhì)導(dǎo)致體內(nèi)氧化還原平衡態(tài)被打破，造成蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物大分子的氧化損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死和代謝紊亂，引發(fā)機(jī)體病變甚至癌癥的發(fā)生。環(huán)境污染物誘發(fā)機(jī)體的毒性效應(yīng)首先發(fā)生在分子水平上，后呈現(xiàn)細(xì)胞乃至機(jī)體效應(yīng)。因此，有必要從生物大分子、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物三個(gè)層面闡明鉛暴露誘發(fā)機(jī)體氧化損傷的作用機(jī)理，從而揭示鉛暴露損害健康的微觀機(jī)制。
　　本文從鉛

3、毒性與氧化應(yīng)激的相關(guān)性這一科學(xué)問題入手，以分子和細(xì)胞毒理學(xué)、儀器分析化學(xué)為背景，聯(lián)合動(dòng)物、細(xì)胞和分子三個(gè)水平研究了鉛誘發(fā)機(jī)體氧化損傷和細(xì)胞凋亡的毒性效應(yīng)及作用機(jī)理。論文主要包括以下五個(gè)部分:
　　第一章概述了鉛進(jìn)入體內(nèi)后吸收和分布的途徑及引發(fā)的毒性作用，介紹了氧化應(yīng)激的誘發(fā)因素及與鉛毒性效應(yīng)的關(guān)系，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平上綜述了鉛暴露誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生氧化應(yīng)激過程中抗氧化應(yīng)激酶、非酶抗氧化物質(zhì)、脂質(zhì)過氧化水平的變化及影響因素，從細(xì)胞水平上綜

4、述了鉛暴露誘發(fā)氧化損傷與細(xì)胞凋亡及相關(guān)信號(hào)通路的相關(guān)性，最后從生物大分子水平上綜述了鉛對(duì)蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子氧化損傷的研究進(jìn)展，分析了三個(gè)水平上鉛毒性評(píng)價(jià)中存在的問題，并提出了聯(lián)合動(dòng)物、細(xì)胞和分子水平研究鉛誘發(fā)氧化損傷和細(xì)胞凋亡的毒性作用機(jī)理的方法。
　　第二章以斑馬魚作為研究對(duì)象，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和生物大分子水平研究了鉛暴露誘發(fā)斑馬魚產(chǎn)生氧化應(yīng)激的作用機(jī)理。本章的部分工作已經(jīng)發(fā)表在the Journal ofPhysical Ch

5、emistry B上。
　　(1)首先對(duì)斑馬魚進(jìn)行了鉛暴露的急性毒性實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了24 h暴露時(shí)間內(nèi)斑馬魚肝臟中抗氧化系統(tǒng)以及氧化損傷程度的影響，評(píng)價(jià)了鉛誘發(fā)的氧化應(yīng)激效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鉛暴露導(dǎo)致抗氧化酶CAT酶活性升高，SOD酶活性降低(CAT和SOD表達(dá)量未發(fā)生明顯變化)，谷胱甘肽相關(guān)酶GPx、GR和GST活性降低，抗氧化物質(zhì)GSH/GSSG比率下降，并對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了氧化損傷，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物MDA含量增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鉛

6、暴露導(dǎo)致斑馬魚肝臟中的氧化還原平衡被打破，誘發(fā)了氧化應(yīng)激效應(yīng)。
　　(2)其次，選取了氧化應(yīng)激過程中其關(guān)鍵保護(hù)作用的兩個(gè)抗氧化酶——CAT和SOD為靶分子，利用多種光譜學(xué)手段、等溫滴定微量熱(ITC)技術(shù)和分子對(duì)接模擬方法從分子水平上研究了鉛誘發(fā)氧化應(yīng)激過程中CAT和SOD酶活性變化的微觀機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鉛暴露引起CAT和SOD酶活性的變化趨勢(shì)在動(dòng)物水平和分子水平上是一致的。由于在本實(shí)驗(yàn)中鉛暴露并未引起斑馬魚肝臟中CAT和SO

7、D表達(dá)量的變化，因此兩種抗氧化酶活性變化的機(jī)理是發(fā)生了鉛與CAT及SOD的直接作用導(dǎo)致了酶結(jié)構(gòu)的變化。具體而言，鉛通過靜電作用（ΔH＜0，ΔS＞0）與酶催化關(guān)鍵氨基酸殘基Arg141發(fā)生了直接作用，使鉛結(jié)合到SOD的活性通道內(nèi)，阻礙了底物(O2-·)進(jìn)入酶活性中心的路徑，破壞了SOD的骨架結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，使活性中心的Cu2+和Zn2+釋放出來，從而導(dǎo)致了SOD活性的下降;鉛結(jié)合到CAT四聚體分子中最大的口袋——CAT分子的中心區(qū)域，該區(qū)

8、域遠(yuǎn)離酶活性中心——卟啉環(huán)處，因此并沒有明顯抑制CAT酶活性。
　　第三章從細(xì)胞水平和分子水平上揭示了鉛暴露誘發(fā)DNA損傷的毒性作用機(jī)理。相關(guān)工作已經(jīng)發(fā)表在Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology上。
　　(1)取健康小鼠原代肝細(xì)胞，標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下(37℃，5％CO2)進(jìn)行24小時(shí)鉛暴露實(shí)驗(yàn)。各暴露組細(xì)胞經(jīng)處理后，分別采用彗星實(shí)驗(yàn)和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)(D

9、PC)評(píng)價(jià)了鉛暴露誘發(fā)小鼠原代肝細(xì)胞DNA損傷的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，暴露組中OTM值，％tail DNA及彗星尾長(zhǎng)值等DNA損傷生物學(xué)參數(shù)均顯著增加，表明低劑量鉛暴露導(dǎo)致小鼠原代肝細(xì)胞中核DNA鏈發(fā)生斷裂，且DNA損傷程度呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。然而在彗星實(shí)驗(yàn)的暴露劑量范圍內(nèi)(1-10μMPb2+)，DPC含量并未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)變化，而當(dāng)暴露劑量提高到100μM時(shí)，DPC系數(shù)達(dá)到12.6％，即出現(xiàn)了明顯的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)現(xiàn)象，表明高劑量鉛暴露導(dǎo)

10、致DNA損傷嚴(yán)重，出現(xiàn)了大量的DNA片段。由于鉛離子不能自由進(jìn)入肝細(xì)胞，卻影響了細(xì)胞核內(nèi)DNA的正常結(jié)構(gòu)和功能，表明鉛通過間接作用導(dǎo)致了DNA損傷。這種間接作用正是鉛暴露誘發(fā)肝細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)，造成細(xì)胞內(nèi)活性氧大量積累，對(duì)DNA產(chǎn)生了氧化損傷，造成了DNA鏈斷裂。
　　(2)當(dāng)氧化應(yīng)激程度較深時(shí)，細(xì)胞膜受到活性氧攻擊使膜通透性發(fā)生變化，此時(shí)鉛進(jìn)入細(xì)胞后將會(huì)有機(jī)會(huì)與DNA分子發(fā)生直接作用。因此我們選取次甲基藍(lán)為熒光探針，利用多種

11、光譜學(xué)方法、ITC及分子對(duì)接模擬研究了鉛與DNA發(fā)生直接作用導(dǎo)致DNA損傷的分子機(jī)理。研究表明鉛結(jié)合到DNA分子的4個(gè)結(jié)合位點(diǎn)上，即通過靜電作用方式與DNA的磷酸骨架結(jié)合，并通過與DNA的嘌呤和嘧啶反應(yīng)結(jié)合到DNA的小溝槽中，從而破壞了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DNA損傷。
　　第四章從細(xì)胞水平上評(píng)價(jià)了鉛暴露對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞和腎細(xì)胞成活率、凋亡及氧化損傷效應(yīng)的影響，并通過考察影響凋亡的信號(hào)通路ERK和激酶Caspase-3的激活情況

12、與細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的相關(guān)性，研究了鉛導(dǎo)致肝細(xì)胞和腎細(xì)胞凋亡的機(jī)理。另外，選取了抗凋亡相關(guān)蛋白溶菌酶(LYZ)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)為靶分子，從分子水平上研究了鉛導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化損傷和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能變化的機(jī)理。本章的部分工作已經(jīng)發(fā)表在Journal ofuminescence和the Journal of Physical ChemistryB上。
　　(1)選取cell viability&death探針，利用

13、Muse細(xì)胞分析儀測(cè)定了不同鉛暴露劑量、不同染毒時(shí)間內(nèi)肝細(xì)胞和腎細(xì)胞的成活率。結(jié)果表明在染毒時(shí)間為6小時(shí)和12小時(shí)的條件下，肝細(xì)胞和腎細(xì)胞成活率都呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其中腎細(xì)胞成活率對(duì)鉛暴露更加敏感，呈顯著性降低趨勢(shì)。在此基礎(chǔ)上，分別選取了CM-H2DCFDA和NDA為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡分別測(cè)定了鉛暴露12小時(shí)后肝細(xì)胞和腎細(xì)胞中ROS和GSH含量的變化，來考察鉛暴露誘發(fā)氧化應(yīng)激的程度。同時(shí)以AnnexinⅤ&7

14、-AAD為雙色細(xì)胞凋亡熒光探針，利用muse細(xì)胞分析儀測(cè)定了氧化損傷導(dǎo)致的肝細(xì)胞和腎細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示GSH在肝細(xì)胞和腎細(xì)胞中均發(fā)生顯著降低，表明兩類細(xì)胞均發(fā)生了氧化應(yīng)激效應(yīng)。ROS在肝細(xì)胞中含量較高，表明肝細(xì)胞氧化應(yīng)激程度大，但卻未引起較大程度的凋亡;而腎細(xì)胞中ROS含量保持穩(wěn)定，卻檢測(cè)到大幅度的細(xì)胞凋亡。這表明調(diào)控細(xì)胞凋亡的因素并不完全是細(xì)胞的氧化損傷程度。因此依據(jù)凋亡情況研究了凋亡相關(guān)信號(hào)通路ERK（抑制細(xì)胞凋亡）和關(guān)鍵執(zhí)行

15、分子Caspase-3（促進(jìn)細(xì)胞凋亡）的激活情況及其調(diào)控機(jī)理，結(jié)果表明鉛暴露激活了肝細(xì)胞ERK通路，且激活比例與ROS產(chǎn)生量成正比，但Caspase-3僅在高濃度時(shí)被活化;腎細(xì)胞的ERK通路變化規(guī)律也同ROS含量成正比，表明ROS是調(diào)控ERK通路的信使因子。但Caspase-3激酶在腎細(xì)胞中被大幅度激活，從而導(dǎo)致了腎細(xì)胞的大量凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中ROS的產(chǎn)生量與ERK通路的激活比例是成正相關(guān)，表明鉛暴露下細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激產(chǎn)生了過多的活性氧，

16、在活性氧刺激下基因調(diào)控了ERK信號(hào)通路的激活。而細(xì)胞自身的抗氧化防御體系（抗氧化酶，GSH等）會(huì)清除細(xì)胞內(nèi)過量的ROS，盡管如此，肝細(xì)胞中ROS的凈產(chǎn)量仍然較大，從而更大比例的激活了ERK信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制。
　　(2)選取了對(duì)細(xì)胞凋亡效應(yīng)起保護(hù)作用的兩個(gè)蛋白質(zhì)溶菌酶(LYZ)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)，利用多種光譜學(xué)手段、ITC技術(shù)及分子對(duì)接模擬等方法從分子水平上研究了鉛暴露對(duì)LYZ和HCG的結(jié)構(gòu)和功能的影響。結(jié)果表明

17、，乙酸鉛進(jìn)入了LYZ最大的活性口袋，并與位于活性口袋內(nèi)部的起關(guān)鍵催化作用的氨基酸殘基(Glu35，Asp52)及具有特征熒光的氨基酸殘基（Trp62，Trp108）發(fā)生相互作用，導(dǎo)致LZ骨架結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)僅發(fā)生改變，從而導(dǎo)致了酶活性下降;在Pb-HCG的反應(yīng)體系中，鉛動(dòng)態(tài)地猝滅了HCG的熒光信號(hào)，其結(jié)合常數(shù)在298k，303k和310k的反應(yīng)溫度下均為103M-1的數(shù)量級(jí)。ITC和分子對(duì)接模擬結(jié)果表明，乙酸鉛通過靜電作用力(ΔH＜0，Δ

18、S＞0)和疏水作用力(ΔH＞0，ΔS＞0)結(jié)合到HCG的5個(gè)作用位點(diǎn)上。紫外可見吸收光譜、圓二色譜及ELISA法結(jié)果表明，鉛破壞了HCG的骨架結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了HCG生物活性的下降。
　　第五章對(duì)論文的研究?jī)?nèi)容進(jìn)行了歸納總結(jié)，并分析了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、原代細(xì)胞和生物大分子三個(gè)層面上聯(lián)合研究鉛導(dǎo)致氧化損傷的優(yōu)勢(shì)與創(chuàng)新，并展望了該研究領(lǐng)域未來的發(fā)展方向。本研究從分子、細(xì)胞和動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)的角度較系統(tǒng)、全面地闡明了鉛誘發(fā)機(jī)體氧化損傷和細(xì)胞凋亡