通關(guān)藤致u937 細(xì)胞凋亡效應(yīng)與機(jī)制

1、<p>　　通關(guān)藤致U937 細(xì)胞凋亡效應(yīng)與機(jī)制</p><p>　　摘　要：目的： 研究通關(guān)藤對(duì)U937細(xì)胞凋亡效應(yīng)與調(diào)控及周期改變。方法：應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)不同濃度通關(guān)藤對(duì)U937細(xì)胞的增殖抑制作用，以Annexin-Ⅴ/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，以RT-PCR法檢測(cè)bax、bcl-2、p53的基因表達(dá)水平的改變。結(jié)果：10、20、40、80μL/ mL通關(guān)藤對(duì)U937細(xì)胞染毒24h后，細(xì)

2、胞相對(duì)增殖率為93.33%、86.20%、76.42%、56.75%，10、20、40、80μL/ mL 通關(guān)藤對(duì)U937細(xì)胞染毒24h后的凋亡率為5.67%、7.51%、13.49%、21.61%，10、20、40μL/ mL 通關(guān)藤對(duì)U937細(xì)胞染毒24h后bax/bcl-2的比值為1.35、2.58、4.45，p53的相對(duì)表達(dá)水平為1.57、2.36、3.57。結(jié)論： 通關(guān)藤能抑制U937細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且具有劑量反應(yīng)

3、關(guān)系，其凋亡的機(jī)制可能與Bax/Bcl-2的上升，及p53的mRNA表達(dá)的上調(diào)有關(guān)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：通關(guān)藤；U937細(xì)胞；細(xì)胞毒性；Bax/Bcl-2；P53 </p><p>　　近年來，傳統(tǒng)中藥通關(guān)藤在實(shí)體瘤的臨床治療中取得了較好的療效[1-3]。但通關(guān)藤注射液在血液腫瘤治療中應(yīng)用較少。有研究表明，低濃度的通關(guān)藤可誘導(dǎo)白血病 NB4 細(xì)胞分化, 高濃度可通過 線粒體途徑誘

4、導(dǎo)白血病細(xì)胞U937, HL60凋亡[4-5] 。為進(jìn)一步探討通關(guān)藤抗白血病的作用及相關(guān)凋亡的可能機(jī)制, 本文用體外對(duì)U937細(xì)胞進(jìn)行不同濃度的通關(guān)藤染毒，觀察對(duì)U937細(xì)胞的抑制作用，對(duì)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的影響并檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)。</p><p><b>　　1　材料與方法</b></p><p><b>　　1.1　材料</b></p

5、><p>　　1.1.1 細(xì)胞株：</p><p>　　U937 細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。</p><p>　　1.1.2 主要試劑及儀器：</p><p>　　通關(guān)藤注射液( 消癌平注射液, 20 mL/ 支, 批號(hào):20070405111)、凱基活細(xì)胞/凋亡細(xì)胞/壞死細(xì)胞鑒別試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；Mithras LB9

6、41多功能酶標(biāo)儀（德國(guó)Berthold technologics），PCR儀(Eppendorf-AG)，凝膠成像處理系統(tǒng)(ChemilmagerTM 5500 Alpha innotech)，ABI 7300型熒光定量PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)中國(guó)公司）。</p><p><b>　　1.2　方法</b></p><p>　　1.2.1 通關(guān)藤對(duì)U937細(xì)胞的增值

7、抑制作用</p><p>　　以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基正常培養(yǎng)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，用含通關(guān)藤終濃度為, 10、20、40、80μL/ mL的培養(yǎng)基100μl染毒24 h，每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)平行。染毒結(jié)束后吸取培養(yǎng)基，加入含10% MTT的無血清培養(yǎng)基100μl作用4 h，再吸取培養(yǎng)基，加入150 ?l DMSO溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物,每

8、孔平行吸取三次各150 ?l到96孔板在酶標(biāo)儀上選擇490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值(A)。按公式計(jì)算各組細(xì)胞相對(duì)增值率, 細(xì)胞相對(duì)增值率(%) = (各染毒組A值-空白組A值) ×100% /（陰性對(duì)照A值-空白組A值)。</p><p>　　1.2.2 通關(guān)藤對(duì)U937細(xì)胞凋亡作用</p><p>　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以2×105 個(gè)/孔接種于六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24

9、 h。劑量效應(yīng)研究：用含通關(guān)終濃度為0、10、20、40、80μl/ml的培養(yǎng)基3ml分別染毒24 h；每組設(shè)3個(gè)平行。染毒結(jié)束后，胰酶消化，離心（2000轉(zhuǎn)，5min）收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次（2000轉(zhuǎn)，5min），加入500μL 的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞；加入5μL Annexin V-FITC混勻后，加入5μL Propidium Iodide，混勻。室溫，避光，反應(yīng)15min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)E

10、x=488nm；發(fā)射波長(zhǎng)Em=530nm。Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測(cè)；PI紅色熒光通過PI通道（FL2或FL3）檢測(cè)。</p><p>　　1.2.3 通關(guān)藤對(duì)U937細(xì)胞Bax、Bcl-2 和 p53表達(dá)影響</p><p>　　同以上染毒方法獲取細(xì)胞，trizol法提取總RNA，用RT-PCR 方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞Bax、Bcl-2 和 p53基因

11、表達(dá)。設(shè)計(jì)引物如下：Bax引物：上游：5’-GGTGCCTCAGGATGCG-3’，下游：5’-GGAGTCTGTGTCCACG-3’，擴(kuò)增片段115bp；Bcl-2引物：上游：5-TCGATGTGATGCCTCTGCGAAGAAC-3’，下游：5’-ATTGCACTGCCAAACGGAGCTG -3’，擴(kuò)增片段112bp；以β-actin為參比基因：上游：5’-ATCCGCAAAGACCTGT-3’，下游：5’-GGGTGTAACGC

12、AACTAAG-3’，擴(kuò)增片段293bp。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，變性15s（95℃），退火1min（60℃），40個(gè)循環(huán)。</p><p>　　1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法</p><p>　　采用 SPSS 13. 0 軟件進(jìn)行分析，資料以?x±s 表示，計(jì)量資料組間差異采用單因素方差分析。</p><p><b>　　2　結(jié)　果<

13、/b></p><p>　　2.1 通關(guān)藤對(duì)U937細(xì)胞的增值抑制作用</p><p>　　MTT結(jié)果顯示，對(duì)照組相比，不同染毒濃度下作用24h后的細(xì)胞相對(duì)增殖率低于對(duì)照組，，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1） </p><p>　　表1 U937細(xì)胞在通關(guān)藤不同濃度作用24h后的吸光度(x±s,%)</p><p>　　*與對(duì)照組

14、相比，P&lt;0.05.</p><p>　　2.2 通關(guān)藤對(duì)U937細(xì)胞的凋亡作用</p><p>　　根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，隨著通關(guān)藤濃度的增高，U937的凋亡率在10~80μL/ mL時(shí)分別為4.67%、6.8%、11.93%、20.70%，且隨著通關(guān)藤濃度上升而逐漸上升，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。</p><p>　　表2 U937

15、細(xì)胞在通關(guān)藤不同濃度作用24h后凋亡率（100%）</p><p>　　*與對(duì)照組相比，P&lt;0.05.</p><p>　　2.3 通關(guān)藤對(duì)U937細(xì)胞Bax、Bcl-2和 p53表達(dá)影響</p><p>　　10、20、40μL/ mL通關(guān)藤作用24h后, U93細(xì)胞bax、bcl-2、p53基因表達(dá)水平均有所上調(diào)，Bax的mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為

16、1.52、2.48、3.78，隨著濃度上升而表達(dá)上升，且與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Bcl-2的相對(duì)表達(dá)水平為1.13、0.96、0.85，Bax/bcl-2值則分別為1.35、2.58、4.45，P53的相對(duì)表達(dá)水平為1.57、2.36、3.57，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表3)。</p><p>　　表3 不同濃度通關(guān)藤作用24h后對(duì)U937細(xì)胞bax,bcl-2,p53基因相對(duì)表達(dá)水平的影響</p

17、><p>　　*與對(duì)照組相比，p&lt;0.05.</p><p><b>　　3　討　論</b></p><p>　　現(xiàn)代干細(xì)胞理論認(rèn)為，白血病是造血干祖細(xì)胞發(fā)生惡性變化所致的惡性增殖性疾病。各種類型的白血病通常有特征性的細(xì)胞遺傳學(xué)異常。本研究通過用通關(guān)藤對(duì)U937細(xì)胞進(jìn)行體外染毒，研究其細(xì)胞凋亡效應(yīng)，并且通過檢測(cè)bax、bcl-2、p5

18、3三個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平來研究其可能機(jī)制。研究結(jié)果表明，通關(guān)藤對(duì)U937細(xì)胞具有增殖抑制效應(yīng)，并能夠誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡。RT-PCR結(jié)果顯示，bax/bcl-2的比值上調(diào)，p53的表達(dá)水平也上升。Bcl-2 和 Bax 是 Bcl-2 家族中兩個(gè)典型的抑凋亡和促凋亡蛋白，且二者通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bax形成同源二聚體時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Bax與 Bc1-2形成異源二聚體時(shí)則實(shí)現(xiàn)Bcl-2 抑制細(xì)胞凋亡的功能[6]

19、。Bax與Bcl-2的比值決定同源二聚體(Bax/Bax)與異源二聚體(Bcl-2/Bax) 的比值，這對(duì)決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡狀態(tài)有重要意義。P53有影響細(xì)胞周期，引導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。實(shí)驗(yàn)中，P53的表達(dá)也隨通關(guān)藤濃度的增加而出現(xiàn)增加的趨勢(shì)。根據(jù)以上的結(jié)果分析，通關(guān)藤誘導(dǎo)HELF細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與Bax/ Bcl-2的上升，及p53的m</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b><

20、/p><p>　　[1] 孫玨, 沈建華, 朱美華, 等. 消癌平對(duì)人胃癌細(xì)胞治療作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 14( 2) :41-43.</p><p>　　[2] 袁秀英. 范忠澤, 黃秀英. 消癌平注射液治療14例晚期胃癌的臨床觀察[J] . 上海醫(yī)藥, 1996, 6: 15-16.</p><p>　　[3] 王文榮, 崔生達(dá),

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22、李翠萍, 等. 消癌平注射液對(duì)白血病細(xì)胞NB4作用的初步研究[J] . 中國(guó)生化藥物雜志,2007, 28( 4) :247-250.</p><p>　　[6] Lalier L，Cartron PF，Juin P，et a1. Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis[J]. Apoptosis，2007, 12(5): 887－