大鼠皮膚切創(chuàng)后E-選擇素表達(dá)及死后穩(wěn)定性研究.pdf

1、研究背景及目的：皮膚作為人體最大的器官，與外界直接接觸，對(duì)機(jī)體具有重要的屏障和保護(hù)作用，其最易遭受機(jī)械性損傷.在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，皮膚損傷時(shí)間的推斷常是法醫(yī)工作者需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。正因?yàn)槿绱?，關(guān)于皮膚損傷時(shí)間推斷方面的研究，一直以來(lái)是國(guó)內(nèi)外法醫(yī)病理學(xué)者的研究熱點(diǎn)問(wèn)題之一。E-選擇素是細(xì)胞粘附分子（adhesion molecule，AM）中選擇素家族（selectin family，SF）成員之一。在體內(nèi)分布非常局限，主要由毛細(xì)血管、后微

2、靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞分泌，其胞內(nèi)無(wú)儲(chǔ)存。它只在外傷、炎癥等刺激后在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)，且具有特異性。E-選擇素產(chǎn)生后，參與記憶T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的聚集，以及內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、管狀形成和毛細(xì)血管的生成，但最主要是介導(dǎo)血液中中性粒細(xì)胞粘附。E-選擇素參與損傷早期修復(fù)作用，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)E-選擇素的研究多側(cè)重于臨床方面，而對(duì)于它在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域方面對(duì)皮膚損傷后不同時(shí)間的表達(dá)變化及死后穩(wěn)定性的研究甚少。尤其是國(guó)內(nèi)對(duì)E-選擇

3、素在皮膚機(jī)械性損傷修復(fù)時(shí)間的推斷方面幾乎未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立大鼠皮膚切創(chuàng)損傷模型，運(yùn)用免疫組化技術(shù)及其陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)損傷組織進(jìn)行E-選擇素的檢測(cè)與分析，探討在皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中其表達(dá)的時(shí)序性變化規(guī)律，以及死后穩(wěn)定性狀況，有可能為法醫(yī)病理學(xué)皮膚損傷時(shí)間的推斷，鑒別生前傷和死后傷提供一個(gè)新的理論依據(jù)。 方法：采用完全隨機(jī)分組方法，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組又分為生前造創(chuàng)組、死后造創(chuàng)組、死后穩(wěn)定性-20℃和25℃組。根據(jù)造創(chuàng)后處

4、死時(shí)間不同，將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為傷后30min、1h、2h、3h、5h、7h、9h、12h、1d、3d、5d、7d共12亞組；死后造創(chuàng)組分為0.5h，1h，3h共3亞組；另設(shè)一組為正常對(duì)照組，即未造創(chuàng)組。生前造創(chuàng)組在大鼠頭部制做全層切創(chuàng)，在預(yù)定時(shí)間分別頸椎脫臼法處死后即刻取材；死后造創(chuàng)組于處死大鼠后在預(yù)定時(shí)間造創(chuàng)取材。死后穩(wěn)定性組中將大鼠造創(chuàng)后于ld將它們頸椎脫臼法處死。隨機(jī)分為14亞組，其中9亞組置于-20℃環(huán)境中，于6h、12h和1d

5、、2d、3d、4d、5d、6d、7d取材；另5亞置于25℃環(huán)境中，于6h、12h和1d、2d、3d取材。取材皮膚組織用多聚甲醛-PBS液中固定后，石蠟包埋切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色光鏡觀察；采用免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行E-選擇素染色，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：1、HE染色觀察：傷后1h，創(chuàng)口周圍毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，組織間水腫；傷后12h內(nèi)，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞游出，主要以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主；傷后1～3d

6、，肉芽組織逐漸形成并大量增生，炎性細(xì)胞以單核-巨噬細(xì)胞為主；傷后5～7d，肉芽組織成熟，成纖維細(xì)胞生成，炎性細(xì)胞消失，創(chuàng)口基本愈合。死后造創(chuàng)組及正常對(duì)照組鏡下無(wú)上述改變。死后在-20℃下6小時(shí)至7d，皮膚損傷部位組織結(jié)構(gòu)與斷頸處死即刻基本一樣，沒(méi)有發(fā)生明顯變化，在第6、7d可見(jiàn)其內(nèi)極少數(shù)炎癥細(xì)胞結(jié)構(gòu)欠清晰，核固縮、粹裂，但邊緣、組織結(jié)構(gòu)較清楚；在25℃下，皮膚損傷部位組織中炎癥細(xì)胞、部分組織細(xì)胞逐漸自溶；以至損傷邊緣結(jié)構(gòu)模糊不清。2、免

7、疫組織化學(xué)SABC法染色觀察：傷后1h，創(chuàng)緣周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，以后持續(xù)升高，至傷后1d，陽(yáng)性表達(dá)達(dá)到高峰：以后表達(dá)逐漸減弱，至傷后7d，仍可見(jiàn)有少量陽(yáng)性表達(dá)。-20℃死穩(wěn)定性組中，不同時(shí)間陽(yáng)性表達(dá)與傷后1d處死即刻沒(méi)有明顯變化；25℃環(huán)境中，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，組織及細(xì)胞的自溶，各亞組的表達(dá)情況與傷后1d處死即刻有明顯變化，陽(yáng)性表達(dá)逐漸減少，在2d時(shí)未見(jiàn)表達(dá)。在正常對(duì)照組及死后傷組中均未見(jiàn)E-選擇素表達(dá)。3、陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)

8、法結(jié)果：陽(yáng)性細(xì)胞率（PR值）在傷后1h到傷后1d逐漸上升，傷后1d達(dá)到高峰，傷后3d～7d，PR值逐漸下降。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果：方差分析結(jié)果表明生前創(chuàng)傷各相鄰兩組之間E-選擇素PR值相比均具有顯著差異（P<0.01）。其中生前創(chuàng)傷1d組與其他各時(shí)間組相比均有顯著差異（P<0.01）。 結(jié)論：大鼠皮膚切創(chuàng)后E-選擇素可迅速增量表達(dá)，且與時(shí)間相關(guān)，呈一定規(guī)律性，呈上升-高峰-下降的時(shí)序變化；在傷后1d達(dá)到高峰。E選擇素在生前及死后均