小檗堿對(duì)DSS結(jié)腸炎小鼠保護(hù)作用的研究.pdf

1、[目的]
　　建立小鼠結(jié)腸炎模型，在整體、組織、細(xì)胞、分子水平探索小檗堿對(duì)結(jié)腸炎治療作用的機(jī)制，為開發(fā)小檗堿作為治療結(jié)腸炎使用的新用途提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　[方法]
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立
　　建模分兩個(gè)階段，第一個(gè)階段是葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium，DSS）誘導(dǎo)結(jié)腸炎階段，第二個(gè)階段是小檗堿治療階段，不同的實(shí)驗(yàn)組在兩個(gè)階段有不同的處理。將C57雄性小鼠按體重和性別隨機(jī)分為4組，分

2、別為不做任何處理的空白對(duì)照組、小檗堿低劑量組和高劑量組、模型組。除了空白對(duì)照組外，其他三組均飼喂2％DSS，第五天撤掉DSS。低、高劑量實(shí)驗(yàn)組在第6天分別給藥50mg/kg、100mg/kg小檗堿，連續(xù)給藥三天。監(jiān)測(cè)并記錄小鼠的體重、溏便、便血等變化。
　　2.組織HE染色評(píng)價(jià)
　　建模第10天取結(jié)腸組織，并用10%中性福爾馬林固定組織，石蠟包埋機(jī)包埋，切片機(jī)進(jìn)行切片，經(jīng)過脫蠟、水化處理，再進(jìn)行HE染色，熒光顯微鏡下拍照觀察

3、，并對(duì)HE染色結(jié)果進(jìn)行打分。
　　3.小檗堿對(duì)腸道菌群的影響
　　建模第8天分別取各組小鼠的糞便，用無菌PBS溶解成三個(gè)質(zhì)量濃度梯度（10、1、0.1 mg/mL），每個(gè)梯度涂3個(gè)板子，每個(gè)板子涂板600μL糞便菌液，37℃烘箱過夜培養(yǎng)，第2天觀察并計(jì)數(shù)菌落數(shù)量，分析小檗堿對(duì)結(jié)腸炎小鼠糞便菌落數(shù)的影響。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠結(jié)腸炎性細(xì)胞的比例
　　分別取3組（不包括低劑量給藥組）小鼠第10天的結(jié)腸組織，分離

4、結(jié)腸固有層單核細(xì)胞，標(biāo)記兩組流式抗體，避光，冰上放置30 min，再用含3%血清的1640培養(yǎng)基洗掉抗體，最后用2%多聚甲醛固定，暫時(shí)放4℃冰箱避光保存。將固定好的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到流式上樣管中檢測(cè)。
　　5.Q-PCR檢測(cè)結(jié)腸組織中炎性因子的表達(dá)
　　分別取4組小鼠第10天的結(jié)腸組織，于液氮中研磨至粉末，然后在超凈臺(tái)中加入Trizol和氯仿，分層取水相，加入等體積異丙醇離心得到RNA沉淀，75%乙醇洗沉淀，最后用無RNA酶的水溶解

5、沉淀即得RNA，-80℃保存。提取的RNA經(jīng)DNA酶消化去除DNA后，70℃金屬浴處理10 min，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后進(jìn)行Q-PCR，用IQ5軟件分析數(shù)據(jù)。
　　[結(jié)果]
　　1.建模過程中小鼠的變化
　　1.1.體重變化趨勢(shì)
　　建模過程中每天測(cè)量記錄小鼠體重，發(fā)現(xiàn)后期飼喂小檗堿的實(shí)驗(yàn)組小鼠體重逐漸恢復(fù)，且高劑量小檗堿實(shí)驗(yàn)組比低劑量實(shí)驗(yàn)組體重恢復(fù)效果更好，而未給藥小檗堿的實(shí)驗(yàn)組小鼠體重持續(xù)下降，小鼠狀態(tài)較

6、差。
　　1.2.糞便粘稠度變化
　　模型組小鼠隨著腸炎的加重，糞便形態(tài)由最開始的正常糞便逐漸變?yōu)椴怀尚蔚匿绫?；低、高劑量給藥小檗堿的實(shí)驗(yàn)組小鼠在誘導(dǎo)腸炎階段，糞便逐漸變松散，而在小檗堿治療階段糞便形態(tài)慢慢恢復(fù)至接近正常，而且高劑量給藥小檗堿組比低劑量給藥小檗堿的實(shí)驗(yàn)組小鼠便溏恢復(fù)效果更好。空白對(duì)照組小鼠糞便形狀無變化。
　　1.3.肛門出血變化
　　模型組小鼠隨著腸炎的加重，肛門處由隱匿性出血逐漸變?yōu)槿庋劭梢姷?/p>

7、出血；中、高劑量給藥小檗堿的實(shí)驗(yàn)組小鼠在誘導(dǎo)腸炎階段肛門處逐漸出現(xiàn)肉眼可見的出血，而在小檗堿治療階段出血情況恢復(fù)好轉(zhuǎn)，且高劑量給藥小檗堿的實(shí)驗(yàn)組小鼠比低劑量給藥小檗堿的實(shí)驗(yàn)組小鼠肛門出血恢復(fù)效果更好，不做任何處理的空白對(duì)照組小鼠無肛門出血情況出現(xiàn)。
　　1.4.結(jié)腸形態(tài)變化
　　模型組小鼠結(jié)腸變粗變短，而低、高劑量給藥小檗堿實(shí)驗(yàn)組小鼠在治療后結(jié)腸形態(tài)恢復(fù)接近至正常，而且高劑量給藥小檗堿實(shí)驗(yàn)組比低劑量給藥小檗堿實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸恢

8、復(fù)效果更好。
　　2.組織HE染色變化
　　空白對(duì)照組結(jié)腸組織形態(tài)完好，結(jié)構(gòu)分層明顯，無損傷，未見炎癥反應(yīng)；模型組小鼠結(jié)腸組織損傷嚴(yán)重，黏膜層基本結(jié)構(gòu)遭到破壞，杯狀細(xì)胞大量缺失，固有層淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，黏膜肌層可見組織水腫和充血；低、高劑量給藥組小鼠結(jié)腸組織損傷程度減輕，組織結(jié)構(gòu)層次分明，固有層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，杯狀細(xì)胞數(shù)量相對(duì)增多，黏膜肌層未見組織水腫和充血，組織形態(tài)已明顯恢復(fù)。
　　3.小檗堿對(duì)腸道菌群的影響

9、>　　空白對(duì)照組菌落數(shù)很少，僅為104個(gè)數(shù)量級(jí)；給小檗堿后的小鼠糞便中菌落數(shù)明顯減少（P<0.01），抑制損傷后腸道菌群的繁殖，從而發(fā)揮保護(hù)功能。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠結(jié)腸炎性細(xì)胞的比例
　　在單核細(xì)胞比例方面，低劑量給藥組和模型組小鼠結(jié)腸無明顯差異；而在中性粒細(xì)胞方面，低劑量給藥組比模型組比例明顯降低，推測(cè)小檗堿抑制結(jié)腸炎的主要機(jī)制可能是通過抑制了中性粒細(xì)胞遷移和聚集來實(shí)現(xiàn)的。
　　5.Q-PCR檢測(cè)結(jié)腸組織中