小檗堿對DSS結腸炎小鼠保護作用的研究.pdf

1、[目的]
　　建立小鼠結腸炎模型，在整體、組織、細胞、分子水平探索小檗堿對結腸炎治療作用的機制，為開發(fā)小檗堿作為治療結腸炎使用的新用途提供實驗依據(jù)。
　　[方法]
　　1.實驗動物模型的建立
　　建模分兩個階段，第一個階段是葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium，DSS）誘導結腸炎階段，第二個階段是小檗堿治療階段，不同的實驗組在兩個階段有不同的處理。將C57雄性小鼠按體重和性別隨機分為4組，分

2、別為不做任何處理的空白對照組、小檗堿低劑量組和高劑量組、模型組。除了空白對照組外，其他三組均飼喂2％DSS，第五天撤掉DSS。低、高劑量實驗組在第6天分別給藥50mg/kg、100mg/kg小檗堿，連續(xù)給藥三天。監(jiān)測并記錄小鼠的體重、溏便、便血等變化。
　　2.組織HE染色評價
　　建模第10天取結腸組織，并用10%中性福爾馬林固定組織，石蠟包埋機包埋，切片機進行切片，經(jīng)過脫蠟、水化處理，再進行HE染色，熒光顯微鏡下拍照觀察

3、，并對HE染色結果進行打分。
　　3.小檗堿對腸道菌群的影響
　　建模第8天分別取各組小鼠的糞便，用無菌PBS溶解成三個質量濃度梯度（10、1、0.1 mg/mL），每個梯度涂3個板子，每個板子涂板600μL糞便菌液，37℃烘箱過夜培養(yǎng)，第2天觀察并計數(shù)菌落數(shù)量，分析小檗堿對結腸炎小鼠糞便菌落數(shù)的影響。
　　4.流式細胞術分析小鼠結腸炎性細胞的比例
　　分別取3組（不包括低劑量給藥組）小鼠第10天的結腸組織，分離

4、結腸固有層單核細胞，標記兩組流式抗體，避光，冰上放置30 min，再用含3%血清的1640培養(yǎng)基洗掉抗體，最后用2%多聚甲醛固定，暫時放4℃冰箱避光保存。將固定好的細胞轉移到流式上樣管中檢測。
　　5.Q-PCR檢測結腸組織中炎性因子的表達
　　分別取4組小鼠第10天的結腸組織，于液氮中研磨至粉末，然后在超凈臺中加入Trizol和氯仿，分層取水相，加入等體積異丙醇離心得到RNA沉淀，75%乙醇洗沉淀，最后用無RNA酶的水溶解

5、沉淀即得RNA，-80℃保存。提取的RNA經(jīng)DNA酶消化去除DNA后，70℃金屬浴處理10 min，反轉錄獲得cDNA，然后進行Q-PCR，用IQ5軟件分析數(shù)據(jù)。
　　[結果]
　　1.建模過程中小鼠的變化
　　1.1.體重變化趨勢
　　建模過程中每天測量記錄小鼠體重，發(fā)現(xiàn)后期飼喂小檗堿的實驗組小鼠體重逐漸恢復，且高劑量小檗堿實驗組比低劑量實驗組體重恢復效果更好，而未給藥小檗堿的實驗組小鼠體重持續(xù)下降，小鼠狀態(tài)較

6、差。
　　1.2.糞便粘稠度變化
　　模型組小鼠隨著腸炎的加重，糞便形態(tài)由最開始的正常糞便逐漸變?yōu)椴怀尚蔚匿绫悖坏?、高劑量給藥小檗堿的實驗組小鼠在誘導腸炎階段，糞便逐漸變松散，而在小檗堿治療階段糞便形態(tài)慢慢恢復至接近正常，而且高劑量給藥小檗堿組比低劑量給藥小檗堿的實驗組小鼠便溏恢復效果更好?？瞻讓φ战M小鼠糞便形狀無變化。
　　1.3.肛門出血變化
　　模型組小鼠隨著腸炎的加重，肛門處由隱匿性出血逐漸變?yōu)槿庋劭梢姷?/p>

7、出血；中、高劑量給藥小檗堿的實驗組小鼠在誘導腸炎階段肛門處逐漸出現(xiàn)肉眼可見的出血，而在小檗堿治療階段出血情況恢復好轉，且高劑量給藥小檗堿的實驗組小鼠比低劑量給藥小檗堿的實驗組小鼠肛門出血恢復效果更好，不做任何處理的空白對照組小鼠無肛門出血情況出現(xiàn)。
　　1.4.結腸形態(tài)變化
　　模型組小鼠結腸變粗變短，而低、高劑量給藥小檗堿實驗組小鼠在治療后結腸形態(tài)恢復接近至正常，而且高劑量給藥小檗堿實驗組比低劑量給藥小檗堿實驗組小鼠結腸恢

8、復效果更好。
　　2.組織HE染色變化
　　空白對照組結腸組織形態(tài)完好，結構分層明顯，無損傷，未見炎癥反應；模型組小鼠結腸組織損傷嚴重，黏膜層基本結構遭到破壞，杯狀細胞大量缺失，固有層淋巴細胞浸潤明顯，黏膜肌層可見組織水腫和充血；低、高劑量給藥組小鼠結腸組織損傷程度減輕，組織結構層次分明，固有層炎性細胞浸潤減少，杯狀細胞數(shù)量相對增多，黏膜肌層未見組織水腫和充血，組織形態(tài)已明顯恢復。
　　3.小檗堿對腸道菌群的影響

9、>　　空白對照組菌落數(shù)很少，僅為104個數(shù)量級；給小檗堿后的小鼠糞便中菌落數(shù)明顯減少（P<0.01），抑制損傷后腸道菌群的繁殖，從而發(fā)揮保護功能。
　　4.流式細胞術分析小鼠結腸炎性細胞的比例
　　在單核細胞比例方面，低劑量給藥組和模型組小鼠結腸無明顯差異；而在中性粒細胞方面，低劑量給藥組比模型組比例明顯降低，推測小檗堿抑制結腸炎的主要機制可能是通過抑制了中性粒細胞遷移和聚集來實現(xiàn)的。
　　5.Q-PCR檢測結腸組織中