β-谷甾醇和豆甾醇對小鼠急性結(jié)腸炎的治療作用研究

1、β谷甾醇和豆甾醇對小鼠急性結(jié)腸炎的治療作用研究馮思敏12寧可1邵平1任國平3孫培龍1羅自生2（浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)科1，浙江杭州310014浙江大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)2，浙江杭州310058杭州萬向職業(yè)技術(shù)學(xué)院3，浙江杭州310023）摘要：要：目的：研究β谷甾醇和豆甾醇對由葡聚糖酸鈉（DSS）誘導(dǎo)C57BL6J雄性小鼠結(jié)腸炎的抑制作用。方法：20只小鼠隨機(jī)分為4組，分別為陰性對照組、DSS處理組（1.5%DSS處理7天），DSS＋

2、β谷甾醇治療組以及DSS＋豆甾醇治療組（植物甾醇溶于純凈玉米油40mgmL，按400mgkgday的劑量灌胃小鼠）。結(jié)果顯示：經(jīng)過13天的試驗(yàn)，DSS處理使小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的急性結(jié)腸炎，伴隨有明顯潰瘍、結(jié)腸上皮組織損傷及結(jié)腸短縮等現(xiàn)象。豆甾醇能顯著抑制結(jié)腸縮短，降低糞便中的血紅素含量，降低結(jié)腸炎病理學(xué)評分（P＜0.05）。并且顯著降低了結(jié)腸組織炎癥因子IL1β、IL6、MCP1和環(huán)氧合酶COX2的mRNA表達(dá)。β谷甾醇也顯著降低了結(jié)腸炎病理

3、學(xué)評分，但只顯著抑制IL6和COX2的表達(dá)。豆甾醇比β谷甾醇表現(xiàn)出了更好的抗急性結(jié)腸炎活性。結(jié)論：飲食中攝入β谷甾醇和豆甾醇能有效改善DSS引起的小鼠結(jié)腸炎，但其在人體中的作用有待進(jìn)一步調(diào)查研究。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：β谷甾醇；豆甾醇；急性結(jié)腸炎；葡聚糖酸鈉；炎癥性腸病中圖分類號：TS201.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：20180205Studyonthetherapeuticeffectofβsitosterolstigmasterolonc

4、olitisinmicemodelFengSimin12NingKe1ShaoPing1RengGuoPing3SunPeilong1LuoZisheng2（1DepartmentoffoodsciencetechnologyZhejiangUniversityoftechnologyHangzhou3100142DepartmentofFoodScienceNutrition，ZhejiangUniversityHangzhou310

5、0583HangzhouWangxiangPolytechnic310023）Abstract:Tostudythetherapeuticeffectofβsitosterolstigmasterolondextransulfatesodium（DSS）inducedcolitisinC57BL6Jmice.About20micewereromlydividedinto4groupsmaintainedonthenegativecont

6、rolgroupDSStreatmentgroup(1.5%DSSinwaterf7days)DSSβsitosteroltreatmentgroupDSSstigmasteroltreatmentgroup(phytosterolinpurecnoil40mgmLgivenbyi.g.withdoseof400mgkgday).After13daytrialDSStreatmentinducedsevereacutecolitiswi

7、thamarkeddisttioninjuryofcolonicepithelialalsoshteningofcolon.Stigmasterolsignificantlyinhibitedcolonshteningloweredthecontentofhemoglobininfecesreducedthehistopathologicalsceofcolitisinthecolon(P0.05).Stigmaterolsignifi

8、cantlydecreasedtheexpressionofseveralproinflammatycytokinessuchasinterleukin(IL)1βIL6monocytechemotacticprotein1(MCP1)alsoenzymecyclooxygenase(COX2).βSitosterolalsosignificantlyreducedtheseverityofcolitisbutonlydecreased

9、theexpressionofCOX2IL6.StigmasterolhavehigherantiinflammatypropertiesthanβSitosterol.Theseresultsindicatethatdietaryintakeofβsitosterolstigmasterolcaneffectivelyameliatecolitisbuttheiractivitiesinhumansremaintobeinvestig

10、ated.Keywds:βSitosterolStigmasterolAcutecolitisDextransulfatesodium(DSS)Inflammatyboweldisease(IBD)炎癥性腸病（InflammatyboweldiseaseIBD）是累及回腸、直腸、結(jié)腸的一種腸道炎性疾病，臨床1基金項(xiàng)目：中國博士后科學(xué)基金面上資助（2017M621970）；浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017C020042018C02049）；杭

11、州市農(nóng)業(yè)科研攻關(guān)專項(xiàng)（20170432B24）收稿日期：20180326作者簡介：馮思敏，男，1989年出生，博士，食品科學(xué)與工程通信作者：孫培龍，男，1964年出生，教授，食品科學(xué)與工程；羅自生，男，1972年出生，教授，農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏每天對小鼠的體重、糞便重量、飲食和水?dāng)z入量進(jìn)行監(jiān)測。CO2窒息處死小鼠后，心臟穿刺取血，血清于－80℃下凍存。切下結(jié)腸，用生理鹽水（0℃）沖洗，并縱向切成兩半。結(jié)腸的一半濾紙上壓平，并放置在10%的福

12、爾馬林緩沖溶液中24小時(shí)后進(jìn)行組織病理學(xué)分析。另一半結(jié)腸存于RNA穩(wěn)定溶液，于－80℃凍存進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）分析。1.3.3小鼠糞便隱血測定用血紅素催化H2O2氧化顯色法來測定糞便中的血紅素含量。具體操作為：取每組0.3g凍干糞便（粉末），加入6mL水，將混合物放在沸水中煮10min滅活植物過氧化物酶。2min后，冰水降溫，加入3mL30%的醋酸。然后，添加4.5mL乙酸乙酯提取血紅素。離心分離，有機(jī)層（0.5mL）加入0.

13、5mL的TMB工作溶液（0.5mmolLTMB溶于20：30：50（vvv）的乙酸：水：乙醇中）和0.5mL3%的H2O2。用分光光度法于660nm測定吸光度。通過與標(biāo)準(zhǔn)比較計(jì)算糞便血紅素含量，三組平行。1.3.4病理切片制作及組織病理學(xué)評分將經(jīng)過福爾馬林固定后的結(jié)腸組織被卷成卷（Swissrolled）后進(jìn)行石蠟包埋，將組織切成4μm切片。每只小鼠取兩片組織切片進(jìn)行蘇木精和曙紅（H&E）染色。急性腸炎的嚴(yán)重程度通過組織病理學(xué)評分系統(tǒng)[

14、17]進(jìn)行評分，盲評結(jié)腸組織病理學(xué)評分。組織學(xué)評分包括炎癥程度、炎癥范圍、杯狀體受損程度、病變面積百分比這四個(gè)單項(xiàng)，具體如表2所示。表2組織學(xué)評分系統(tǒng)組織學(xué)評分系統(tǒng)炎癥反應(yīng)程度評分組織受損程度評分分?jǐn)?shù)炎癥程度炎癥范圍杯狀體受損程度病變面積百分比0無無無0%1輕微炎癥反應(yīng)（聚集或分離多病灶炎癥反應(yīng)）炎癥反應(yīng)涉及黏膜杯狀體從基底計(jì)算縮短13并伴有輕微炎癥反應(yīng)及水腫1～25%2中等炎癥反應(yīng)（多病灶或相當(dāng)廣泛的炎癥反應(yīng)）炎癥反應(yīng)涉及黏膜及黏膜下

15、層杯狀體從基底計(jì)算縮短23并伴有中等炎癥反應(yīng)26～50%3嚴(yán)重炎癥反應(yīng)（黏膜潰瘍，出現(xiàn)大面積單核或多核形白細(xì)胞）腸道穿孔杯狀體完全消失，伴有嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，但表層上皮細(xì)胞還在51～75%4杯狀體和表層上皮細(xì)胞完全消失76～100%1.3.5qPCR分析結(jié)腸組織總RNA根據(jù)RNeasymini試劑盒的官方方法進(jìn)行提取。RNA的濃度和質(zhì)量通過其在260nm到280nm的吸光值及其比值來測定。按照SuperRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的說明利用Gene

16、AmpPCRsystem9700將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)熒光qPCR按照PowerSYBRGreenPCRMasterMix試劑盒的說明和ABIViiATM7qPCR系統(tǒng)進(jìn)行。90℃維持5min啟動(dòng)qPCR反應(yīng)，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的靶基因擴(kuò)增（95℃15s60℃60s）。結(jié)果以目標(biāo)基因表達(dá)量與甘油醛3磷酸脫氫酶（GAPDH）的比值表示。引物序列如表3所示。表3引物序列基因名稱基因序列（53）退火溫度（C）IL1βF:CTGTGAC