利用CD11C-DTR小鼠研究腸道巨噬細(xì)胞在DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎中的作用.pdf

1、目的:
　　潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種病因和發(fā)病機(jī)理尚不十分清楚的慢性腸道炎癥性疾病。研究發(fā)現(xiàn)活動性UC患者的大腸炎癥中巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯增，巨噬細(xì)胞還分泌大量的細(xì)胞因子及生物活性物質(zhì)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。給CD11c-DTR小鼠腹腔注射DT（白喉毒素），可以完全清除腸道巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，而巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在腸道重新發(fā)育回來存在時間窗口期。DT注射后3天后樹突狀細(xì)胞優(yōu)先發(fā)育回來，兩周后巨噬細(xì)胞才能在腸道中發(fā)育回來。

2、利用這種方法我們可以在體內(nèi)研究巨噬細(xì)胞缺失對DSS（葡聚糖硫酸鈉）誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生怎樣的作用。
　　方法:
　　1 流式檢測CD11c-DTR小鼠腹腔注射DT后巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在腸道中發(fā)育回歸窗口期
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測CD11c-DTR小鼠注射DT后不同時間點(diǎn)(1d、3d、1w、2w)大腸固有層巨噬細(xì)胞(IA/IE+F4/80+)和樹突狀細(xì)胞(CD11c+CD11b+)的數(shù)量和比例的變化情況。

3、　　2 建立C57BL/6小鼠DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎模型
　　據(jù)Cooper等的方法，建立急性DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型:將分子量為5000的DSS溶于蒸餾水，配制成5％的DSS溶液，使C57BL/6小鼠自由飲用7天，建立小鼠急性結(jié)腸炎模型。
　　3 檢測巨噬細(xì)胞在DSS誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠急性結(jié)腸炎中的作用
　　流式檢測DSS誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠急性結(jié)腸炎中大腸固有層巨噬細(xì)胞(IA/IE+F4/80+)比例和

4、數(shù)量的變化。免疫組化檢測DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎中大腸固有層巨噬細(xì)胞（IA/IE+F4/80+）數(shù)量的變化。采用Real-Time PCR、ELISA方法，檢測DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎直腸組織相關(guān)細(xì)胞因子分泌情況。
　　4 檢測CD11c-DTR小鼠DT窗口期（巨噬細(xì)胞缺失）DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎免疫病理變化
　　用5％的DSS溶液誘導(dǎo)窗口期小鼠(CD11 c-DTR小鼠腹腔注射DT后第7～14d)建立小鼠急性結(jié)腸炎模型。流式細(xì)胞

5、術(shù)、HE染色觀察在腸道巨噬細(xì)胞缺失的情況下DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展情況。用Real-Time PCR、ELISA為輔助手段，檢測在腸道巨噬細(xì)胞缺失的情況下DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎直腸組織相關(guān)細(xì)胞因子分泌情況。
　　結(jié)果:
　　1 CD11 c-DTR小鼠在腹腔注射DT巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞發(fā)育回歸存在窗口期:CD11c-DTR小鼠在腹腔注射DT（200ng/只）1天后，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞完全清除;CD11c-DTR小鼠在腹

6、腔注射DT(200ng/只)3天后樹突狀細(xì)胞比例有所上升，但并沒有恢復(fù)到正常水平，巨噬細(xì)胞仍然處于完全清除狀態(tài);CD11c-DTR小鼠在腹腔注射DT(200ng/只)7天后樹突細(xì)胞比例完全恢復(fù)到正常狀態(tài)，巨噬細(xì)胞仍然處于完全清除狀態(tài);CD11 c-DTR小鼠在腹腔注射DT(200ng/只)14天后，樹突細(xì)胞比例完全恢復(fù)到正常狀態(tài)，巨噬細(xì)胞仍然處于完全清除狀態(tài)。
　　2 DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎模型成功:使C57BL/6小鼠自由飲用5％

7、DSS溶液，模型組第3～4天開始出現(xiàn)急性結(jié)腸炎癥狀，體重下降、糞便松散、隱血試驗(yàn)陽性最早出現(xiàn)于第3天，稀便和血便最早出現(xiàn)于第4天，糞便含水量在第3～4天開始明顯增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)束小鼠體重下降約50％左右，較對照組有明顯統(tǒng)計學(xué)差異;第8天取全段結(jié)腸，模型組小鼠的結(jié)腸長度較對照組短，有差異有統(tǒng)計學(xué)差異;取第8天全段結(jié)腸，HE染色，全段光鏡下模型組表現(xiàn)為部分上皮脫落，炎癥細(xì)胞親潤，上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞減少，病理學(xué)炎癥評分較對照組有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

8、>　　3 DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎模型中巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加:流式結(jié)果顯示，C57BL/6小鼠DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎模型第7天大腸固有層巨噬細(xì)胞(IA/IE+F4/80+)比例和數(shù)量明顯上升，較對照組有明顯差異。免疫組化檢測DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎第7天大腸固有層巨噬細(xì)胞(IA/IE+F4/80+)數(shù)量明顯上升，較對照組有明顯差異。
　　4 腸道巨噬細(xì)胞缺失，結(jié)腸炎明顯減輕:CD11c-DTR小鼠腹腔注射DT第7天，DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎模

9、型。CD11c-DTR窗口期小鼠模型組較WT(野生型)模型組小鼠臨床癥狀減輕。CD11c-DTR窗口期小鼠模型組較WT（野生型）模型組小鼠病理學(xué)炎癥評分及HE炎癥評分均有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　成功找到CD11c-DTR小鼠腹腔注射DT巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞發(fā)育回歸存在的窗口期，并利用此窗口期研究DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎中巨噬細(xì)胞的作用。發(fā)現(xiàn)在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中，巨噬細(xì)胞缺失會減輕小鼠結(jié)腸炎癥狀態(tài)，顯示巨噬細(xì)胞在