慢性淋巴細(xì)胞白血病自噬相關(guān)基因的表達(dá)及西達(dá)本胺的作用.pdf

1、本文通過(guò)以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 BECN1及ATG5基因在慢性淋巴細(xì)胞白血病的表達(dá)及其臨床意義
　　目的:BECN1及ATG5基因在細(xì)胞自噬中起重要的調(diào)節(jié)作用。本研究探討B(tài)ECN1及ATG5基因在慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)的表達(dá)及其臨床意義。
　　方法:收集100例初診或6個(gè)月未治療的CLL患者和50例健康正常人標(biāo)本，采用SYBR Green熒光染料實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)兩組BECN

2、1及ATG5 mRNA表達(dá)水平，運(yùn)用循環(huán)閾值(Ct)比較法進(jìn)行分析。采用PCR以及DNA序列測(cè)定CLL患者p53和免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(IGHV)突變;流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)CD38及ZAP-70表達(dá);間期熒光原位雜交(FISH)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞遺傳學(xué)異常。分析BECN1及ATG5基因表達(dá)與血清乳酸脫氫酶(LDH)、β2-微球蛋白(β2-MG)及其他預(yù)后因素的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0軟件及GraphPad Prism5.0軟件

3、進(jìn)行，以P＜0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:1.BECN1 mRNA在CLL患者和健康正常對(duì)照組的中位表達(dá)水平分別為0.108和0.035，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.002)。ATG5 mRNA在CLL患者和健康正常對(duì)照組的中位表達(dá)水平分別為為0.084和0.066，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.048)。
　　2.BECN1 mRNA的表達(dá)水平與Binet分期相關(guān)。臨床分期較晚（Binet B期、C期）的患者BECN1表達(dá)水

4、平明顯低于臨床分期較早（Binet A期）的患者(P=0.047)。ATG5mRNA的表達(dá)水平與Binet分期、p53突變狀態(tài)、ZAP-70、CD38等指標(biāo)相關(guān)。臨床分期較早(Binet A期)的患者ATG5表達(dá)水平明顯高于臨床分期較晚（Binet B期、C期）的患者(P=0.001);無(wú)p53突變者ATG5表達(dá)水平要明顯高于有p53突變者(P=0.014);ZAP-70陰性患者ATG5表達(dá)水平明顯高于ZAP-70陽(yáng)性者(P=0.008

5、); CD38陰性患者ATG5表達(dá)水平明顯高于CD38陽(yáng)性者(P=0.007)。
　　3.利用ROC曲線以Binet分期為參照求得ATG5分界值0.090(AUC:0.699;95％ CI:0.595～0.804;敏感性71.0％，特異性69.1％)，可將患者分為兩組，其中ATG5高表達(dá)組的首次治療時(shí)間（TTT）明顯長(zhǎng)于低表達(dá)組(P=0.020)。但Cox多因素生存分析顯示只有Binet分期是TTT的獨(dú)立預(yù)后因素(P=0.001)

6、。
　　結(jié)論:自噬相關(guān)基因BECN1和ATG5 mRNA在CLL細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，提示CLL細(xì)胞自噬水平增高。ATG5 mRNA表達(dá)水平與CLL的不良預(yù)后因素，如ZAP-70、CD38、p53突變狀態(tài)等相關(guān)。
　　第二部分 西達(dá)本胺誘導(dǎo)慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡并抑制自噬的作用
　　目的:本實(shí)驗(yàn)旨在研究自噬和凋亡在西達(dá)本胺治療慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)的作用，為西達(dá)本胺單藥及聯(lián)合用藥治療CLL提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方

7、法:體外培養(yǎng)CLL原代細(xì)胞，應(yīng)用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性。應(yīng)用蛋白免疫印跡雜交(WB)檢測(cè)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)表達(dá)水平。流式細(xì)胞術(shù)(FCM) Annexin-Ⅴ FITC/PI雙染檢測(cè)西達(dá)本胺對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。最后用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因BECN1和ATG5的mRNA表達(dá)水平。FCM檢測(cè)CLL細(xì)胞中CD38和ZAP-70表達(dá)水平，PCR聯(lián)合DNA序列分析測(cè)定p53突變和免疫球蛋白重鏈可變

8、區(qū)(IGHV)突變狀態(tài)，間期熒光原位雜交(FISH)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞遺傳學(xué)異常。采用SPSS17.0及GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P＜0.05代表其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.不同濃度的西達(dá)本胺干預(yù)CLL細(xì)胞24 h和48 h后發(fā)現(xiàn)，西達(dá)本胺以時(shí)間劑量依賴性抑制CLL細(xì)胞的活性。
　　2.CLL細(xì)胞陰性對(duì)照(NC)組的24 h中位凋亡率為20.97％(7.75％～36.8％)。而3-甲基腺嘌呤(

9、3-MA)、氯喹(CQ)、西達(dá)本胺、西達(dá)本胺聯(lián)合CQ組的中位凋亡率分別為29.83％(13.55％～55.1％)、25.33％(9.03％～65.1％)、37.47％(12.18～70.1％)和44.37％(13.36～69.4％)。西達(dá)本胺誘導(dǎo)CLL細(xì)胞凋亡增加(P＜0.001)。與單獨(dú)的西達(dá)本胺干預(yù)相比，CQ聯(lián)合西達(dá)本胺顯著增加CLL細(xì)胞凋亡率(P=0.001)。
　　3.西達(dá)本胺下調(diào)CLL細(xì)胞LC3-Ⅱ的表達(dá)水平(P=0.0

10、01)。LC3-Ⅱ表達(dá)下降是由于西達(dá)本胺降低細(xì)胞的自噬活性，而非自噬體降解增多所導(dǎo)致的。
　　4.西達(dá)本胺下調(diào)CLL細(xì)胞BECN1mRNA表達(dá)水平。3-MA、CQ、西達(dá)本胺、西達(dá)本胺聯(lián)合CQ組BECN1 mRNA中位表達(dá)量分別為0.062(0.008～0.668)、0.054(0.006～0.445)、0.051(0.005～0.348)、0.055(0.004～0.425)。而NC組中位表達(dá)量0.078(0.006～1.000)