消癌解毒方中白花蛇舌草抑制結(jié)腸癌的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授基于癌毒理論總結(jié)的消癌解毒方在臨床中已證實(shí)其卓越的療效，周教授基于癌毒理論治療各組腫瘤最常用的君藥為白花蛇舌草，其在各腫瘤組方中使用頻率高達(dá)74％，尤其在消化系統(tǒng)腫瘤如結(jié)腸癌中，白花蛇舌草更是一直居于周仲瑛教授抗癌組方最重要的地位。中藥抗癌雖然在結(jié)腸癌治療中居于較重要地位，但即使像白花蛇舌草這樣一味抗癌超級(jí)明星中藥，其在抑制腫瘤生長(zhǎng)中的作用及機(jī)制仍不清楚，本研究擬探討白花蛇舌草抗結(jié)腸癌的作用及其分子機(jī)制。

2、　　方法:結(jié)腸癌HCT-116、Lovo、HT-29和DLD-1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，結(jié)腸癌原代細(xì)胞來(lái)自無(wú)錫市人民醫(yī)院手術(shù)切除標(biāo)本。細(xì)胞培養(yǎng)于并維持在RPMI/DMEM培養(yǎng)基中，加入10％的FBS，青霉素/鏈霉素(1∶100，Sigma)，培養(yǎng)在37℃ CO2培養(yǎng)箱中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞給予白花蛇舌草濃度(Ctrl、10、25、50、200μg/ml)和指定的時(shí)間(0、6h、24h、48h、72h、96h)，顯微鏡下

3、觀察細(xì)胞形態(tài)，運(yùn)用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞存活率，同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算活細(xì)胞率;運(yùn)用組蛋白DNA-ELISA及AnnexinⅤ試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，LDH分析法檢測(cè)細(xì)胞死亡率，線粒體免疫共沉淀分離線粒體，Western blot檢測(cè)總的和磷酸化的AMPKα1、ACC、Caspase-3、Bcl-2、HIF-1a、S6K、p53信號(hào)通路的改變，運(yùn)用程序性死亡抑制劑及凋亡抑制劑進(jìn)一步驗(yàn)證白花蛇舌草誘導(dǎo)細(xì)胞死亡方式。建立p53-shRNA、

4、AMPKα1-shRNA及AMPK-α1顯性失活(DN)突變（DN-AMPK-α1）cDNA穩(wěn)轉(zhuǎn)的結(jié)腸癌細(xì)胞，運(yùn)用上述方法進(jìn)一步驗(yàn)證信號(hào)通路的改變。同時(shí)檢測(cè)生長(zhǎng)因子受體包括EGFR、PDGFRα、PDGFRβ和FSCN1的表達(dá)，運(yùn)用上述方法驗(yàn)證其體外活性，建立裸鼠模型，給予一定濃度白花蛇舌草，記錄裸鼠存活率、腫瘤大小，免疫組化檢測(cè)組織AMPKα1表達(dá)，Western blot檢測(cè)總的和磷酸化的AMPKα1、ACC、Caspase-3、B

5、cl-2、HIF-1a、S6K、p53信號(hào)通路的改變，進(jìn)一步驗(yàn)證白花蛇舌草抗結(jié)腸癌作用的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:白花蛇舌草對(duì)HCT-116、Lovo、HT-29和DLD-1及原代結(jié)腸癌細(xì)胞均有抑制細(xì)胞活力、導(dǎo)致死亡、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。運(yùn)用Caspase-3特異性抑制劑顯著降低白花蛇舌草導(dǎo)致的HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞死亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明Caspase-3介導(dǎo)了白花蛇舌草誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。通過(guò)LDH釋放的增

6、加，檢測(cè)白花蛇舌草誘導(dǎo)的HCT-116細(xì)胞壞死，表明白花蛇舌草的細(xì)胞毒性對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，白花蛇舌草作用于結(jié)腸癌細(xì)胞，可活化AMPK，抑制mTORC1的活性，并下調(diào)下游Bcl-2和HIF-1α基因表達(dá)。通過(guò)抑制AMPKα1活性，mTORC1抑制釋放，Bcl-2和HIF-1α表達(dá)又增加。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草活化AMPK后，導(dǎo)致p53磷酸化激活，以引發(fā)細(xì)胞程序性壞死。并且，AMPK活化后又促進(jìn)生長(zhǎng)因