白花蛇舌草含藥血清對(duì)SMMC-7721人肝癌細(xì)胞的生長和分化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：中草藥對(duì)腫瘤的防治作用研究已經(jīng)成為腫瘤治療的新的熱點(diǎn)領(lǐng)域。白花蛇舌草具有清熱解毒，活血化瘀，利水消腫及抗腫瘤的作用。實(shí)驗(yàn)研究表明，白花蛇舌草的有效成分熊果酸有抗突變，抗促癌，抗氧化，抗血管生成和誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化等抗腫瘤活性，白花蛇舌草的另外一個(gè)有效成分齊墩果酸可以抑制多種實(shí)體移植瘤的生長。本研究旨在探討抗腫瘤中藥白花蛇舌草對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的生長和分化的影響及其可能的機(jī)制。為肝臟腫瘤的中醫(yī)藥治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2、 方法：采用血清藥理學(xué)方法，應(yīng)用光、電鏡、免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞儀分析等分子生物學(xué)技術(shù)和方法，觀察白花蛇舌草含藥血清對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721人肝癌細(xì)胞的生長曲線、細(xì)胞分裂指數(shù)、細(xì)胞抑制率、細(xì)胞周期、細(xì)胞集形成率、組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、AFP．P53.Bc1-2.CyclinD1和 Ki-67蛋白的表達(dá)，評(píng)價(jià)白花蛇舌草對(duì)SMMC-7721的誘導(dǎo)分化作用和機(jī)制。 結(jié)果：白花蛇舌草含藥血清對(duì)SMMC-7721人肝癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)上具

3、有影響作用，對(duì)照組SMMC-7721人肝癌細(xì)胞貼壁生長良好，細(xì)胞為上皮樣形態(tài)，卵圓形，多邊形或星形等不規(guī)則形態(tài)。核分裂像多見，核/漿比例倒置，核異型明顯，HE染色細(xì)胞著色不均勻。處理組中10％含藥血清組細(xì)胞1d～7d形態(tài)與對(duì)照組相似，隨著含藥血清濃度的增大，細(xì)胞形態(tài)向正常方向逆轉(zhuǎn)明顯，培養(yǎng)液中細(xì)胞排列疏松，貼壁細(xì)胞外觀比對(duì)照組圓。20％，30％含藥血清組SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異不大，細(xì)胞體積比10％濃度組大，細(xì)胞質(zhì)更加豐富，核漿

4、比例低，細(xì)胞核相對(duì)較小。但是貼壁細(xì)胞的數(shù)量隨濃度的增加而明顯減少。胞質(zhì)較豐富，HE染色著色均勻一致。 電鏡觀察對(duì)照組SMMC-7721人肝癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，可見SMMC-7721細(xì)胞生長良好，細(xì)胞表面微絨毛突起較多，細(xì)胞內(nèi)含有豐富的糖原，而游離的核糖體多，這些形態(tài)顯示來源于上皮組織。處理組SMMC-7721人肝癌細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，超微結(jié)構(gòu)都發(fā)生了明顯的變化，表現(xiàn)為，細(xì)胞體積增大，形狀變規(guī)則，不規(guī)則的形態(tài)的細(xì)胞數(shù)量減少，多呈卵

5、圓形或近似圓形，細(xì)胞核質(zhì)比例明顯減小，細(xì)胞器增多等類似向正常肝細(xì)胞轉(zhuǎn)變的趨向。 同時(shí)，生長曲線顯示，對(duì)照組SMMC-7721人肝癌細(xì)胞細(xì)胞增殖速度最快，當(dāng)接種細(xì)胞數(shù)為2×104/ml時(shí)，連續(xù)計(jì)數(shù)至第七天，平均細(xì)胞數(shù)是40.98×104/ml，是接種細(xì)胞的20.27倍。不同劑量的白花蛇舌草含藥血清連續(xù)誘導(dǎo)第七天后，SMMC-7721人肝癌細(xì)胞的生長狀態(tài)受到了不同程度的抑制，其中，10％濃度組的細(xì)胞計(jì)數(shù)平均為21.02×104/ml

6、，為初始細(xì)胞數(shù)量的10.32倍，細(xì)胞的生長抑制率達(dá)到49.52％(P<0.05)。20％含藥血清組連續(xù)誘導(dǎo)第七天，細(xì)胞減少到了16.59×104/ml，是初始接種濃度的8.35倍，細(xì)胞生長抑制率達(dá)到58.65％，與對(duì)照組相比較，具有顯著性差異(P<0.05)，而經(jīng)過30％含藥血清處理的SMMC-7721人肝癌細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果是16.13×104/ml，細(xì)胞數(shù)是初始接種的8.026倍，細(xì)胞生長抑制率高達(dá)60.28％(P<0.05)．在

7、細(xì)胞集落形成率方面，對(duì)照組SMMC-7721人肝癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的集落形成能力，細(xì)胞集落數(shù)目較多，均值高達(dá)45.87個(gè)/cm2，經(jīng)過三種不同濃度含藥血清誘導(dǎo)處理后的SMMC-7721細(xì)胞停止誘導(dǎo)作用后一周，觀察細(xì)胞生長，仍然處于抑制；10％含藥血清處理組細(xì)胞集落形成的數(shù)目是31.76個(gè)/cm2，集落形成抑制率達(dá)到34.61％，與對(duì)照組相比，差異顯著(P<0.05)，其細(xì)胞集落體積變小，多數(shù)細(xì)胞處于鋪展?fàn)顟B(tài)或伸出胞質(zhì)突起，30％濃度組細(xì)胞集

8、落形成數(shù)目為27.6個(gè)/cm2，抑制率達(dá)到43.17％(P<0.05)，20％含藥血清組細(xì)胞集落形成能力介于兩者之間。集落數(shù)目下降為30.73個(gè)/cm2。 在細(xì)胞分裂指數(shù)方面，細(xì)胞的分裂指數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示， SMMC-7721人肝癌細(xì)胞具有旺盛的生長能力，在接種后的第四天分裂指數(shù)最大，為37.28‰，在處理組中，不同的時(shí)間點(diǎn)，分裂指數(shù)均有下降，但仍已第四天最為明顯。與對(duì)照組相比，處理組SMMC-7721分裂指數(shù)下降明顯，分裂指數(shù)為

9、16.32‰，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組SMMC-7721細(xì)胞G1期細(xì)胞比例為52.2％,S期比例為23.6％，G2期比例為24.2％，經(jīng)不同濃度百花蛇舌草含藥血清處理的SMMC-772l細(xì)胞周期均出現(xiàn)明顯的G1期阻抑現(xiàn)象。其中10％含藥血清組細(xì)胞即發(fā)生G1期阻抑，G1期細(xì)胞比例由52.2％上升到70.6％；而S期細(xì)胞比例由23.6％下降為20％；G2期細(xì)胞比例由24.2％下

10、降為9.4％。提示產(chǎn)生G1期阻抑。第2天、第3天結(jié)果更明顯。與對(duì)照組相比，20％含藥血清組處理的SMMC-7721細(xì)胞第1d，G1期細(xì)胞比例略有增加，占57.9％；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加G1期為71.7％，而S期的細(xì)胞比例略有增加；細(xì)胞明顯被阻滯于G1期。30％含藥血清組G1期阻滯現(xiàn)象更加明顯：G1期細(xì)胞比例高73.4％，S期、G2期細(xì)胞比例進(jìn)一步減少，與中劑量組，低劑量組相比，G1期阻滯現(xiàn)象更加明顯，提示存在量效關(guān)系。30％含藥血清組同時(shí)

11、可見凋亡峰，提示其同時(shí)具有促進(jìn)凋亡，抑制增殖作用。 白花蛇舌草含藥血清對(duì)SMMC-7721細(xì)胞AFP表達(dá)的影響方面，對(duì)照組胞質(zhì)中表達(dá)最強(qiáng)，隨機(jī)5個(gè)高倍視野陽性細(xì)胞數(shù)大于75％，評(píng)4分；顏色強(qiáng)度為棕褐色，評(píng)3分；根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，其綜合評(píng)分為11-12分，呈強(qiáng)陽性(＋＋＋)表達(dá)。10％含藥血清組隨機(jī)5個(gè)高倍視野陽性細(xì)胞數(shù)在26％-50％，評(píng)2-3分；顏色強(qiáng)度為棕色，評(píng)2分；根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，其綜合評(píng)分為4-6分，呈中等陽性(＋＋)表達(dá)。2

12、0％含藥血清組隨機(jī)5個(gè)高倍視野陽性細(xì)胞數(shù)在26％-50％，顏色強(qiáng)度為黃色，根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，其綜合評(píng)分為3-4分，呈弱陽性(＋)表達(dá)。 30％含藥血清組隨機(jī)5個(gè)高倍視野陽性細(xì)胞數(shù)在26％-50％，顏色強(qiáng)度為黃色，根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，其綜合評(píng)分為3-4分，呈弱陽性(＋)表達(dá)。提示白花蛇舌草含藥血清能下調(diào)AFP表達(dá)。 應(yīng)用SP免疫組化檢測(cè)各組SMMC-7721人肝癌細(xì)胞突變型P53蛋白(mt p53)表達(dá)的變化，mt p53蛋白主要位于細(xì)胞核

13、，同時(shí)核周邊略呈淺黃色，評(píng)分結(jié)果顯示：對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)P53蛋白在細(xì)胞核表達(dá)最強(qiáng)，隨機(jī)5個(gè)高倍視野陽性細(xì)胞數(shù)大于75％，評(píng)為4分，顏色強(qiáng)度為棕褐色，評(píng)3分，綜合評(píng)分為11—12分，呈強(qiáng)陽性(＋＋＋)表達(dá)。白花蛇舌草含藥血清組細(xì)胞中，P53蛋白表達(dá)明顯降低，陽性細(xì)胞表達(dá)率在48小時(shí)后降為26％-50％之間，評(píng)分4-5分，顏色強(qiáng)度為棕黃色，評(píng)分2分，根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，綜合評(píng)分4-5分，呈弱陽性(＋)表達(dá)。 Bc1-2蛋白主要分布于細(xì)胞核周邊

14、的細(xì)胞質(zhì)中，同時(shí)核上也有不少反應(yīng)產(chǎn)物分布。評(píng)分結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞核內(nèi)的Bc1-2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上表達(dá)最強(qiáng)，隨機(jī)5個(gè)高倍視野陽性細(xì)胞數(shù)大于75％，評(píng)為4分，顏色強(qiáng)度為棕褐色，評(píng)3分，綜合評(píng)分11—12分，呈強(qiáng)陽性(＋＋＋)表達(dá)。白花蛇舌草含藥血清組bc1-2蛋白表達(dá)明顯減弱，隨機(jī)5個(gè)高倍視野陽性細(xì)胞數(shù)大于26％-50％，評(píng)為2分，顏色強(qiáng)度為棕黃色，評(píng)3分，綜合評(píng)分4—6分，呈弱陽性(＋)表達(dá)。 在細(xì)胞周期蛋白CyclinD1蛋

15、白表達(dá)方面，CyclinD1在對(duì)照組中的表達(dá)最高，CyclinD1主要位于細(xì)胞核上，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)中也有不少分布，與核內(nèi)抗原外溢有關(guān)。評(píng)分結(jié)果顯示：對(duì)照組細(xì)胞隨機(jī)5個(gè)高倍視野陽性細(xì)胞數(shù)大于75％，評(píng)為4分，顏色強(qiáng)度為棕褐色，評(píng)3分，綜合評(píng)分11—12分，呈強(qiáng)陽性表達(dá)(＋＋＋)。處理組CyclinD1蛋白表達(dá)明顯減弱，隨機(jī)5個(gè)高倍視野陽性細(xì)胞數(shù)大于26％-50％，評(píng)為2分，顏色強(qiáng)度為棕黃色，評(píng)3分，綜合評(píng)分4—6分，呈弱陽性(＋)表達(dá)。提示白

16、花蛇舌草含藥血清能夠降低CyclinD1蛋白表達(dá)。 在觀察白花蛇舌草含藥血清對(duì)SMMC-7721人肝癌細(xì)胞Ki-67蛋白表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：Ki-67在SMMC-7721對(duì)照組肝癌細(xì)胞中的表達(dá)較高，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物為褐色或黃褐色，Ki-67主要分布在肝癌細(xì)胞的細(xì)胞核中。陽性細(xì)胞可見細(xì)胞核染色為棕褐色或棕黃色。陽性細(xì)胞數(shù)大于75％。處理組細(xì)胞中SMMC-7721人肝癌細(xì)胞Ki-67表達(dá)明顯降低，Ki-67的表達(dá)呈弱陽性，顯色反

17、應(yīng)為淺黃色。陽性細(xì)胞數(shù)25～50％之間。與此同時(shí)對(duì)照組的Ki-67指數(shù)為160.2±51.7，含藥血清組的Ki-67指數(shù)均小于14。兩組比較，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示處理能減少Ki-67表達(dá)。 結(jié)論：白花蛇舌草含藥血清具有抑制SMMC-7721人肝癌細(xì)胞生長增殖、降低細(xì)胞分裂指數(shù)、降低腫瘤細(xì)胞集落形成能力、阻滯細(xì)胞于G1期、使AFP．P53.Bc1-2 CyclinD蛋白表達(dá)明顯下降，具有確切的生長抑制作用；促進(jìn)SMMC