白花蛇舌草逆轉(zhuǎn)乏氧HepG-2細胞對ADM的耐藥性.pdf

1、目的：
　　建立乏氧HepG-2細胞模型，明確其對ADM具有耐藥性。探討白花蛇舌草是否能夠逆轉(zhuǎn)乏氧HepG-2細胞對ADM的耐藥性，并進一步探討其可能的分子機制。
　　方法：
　　臺盼藍拒染色法觀察CoCl2作用后HepG-2細胞的存活率；MTT法測定白花蛇舌草對乏氧HepG-2細胞的抑制率；MTT法分別測定阿霉素作用于普通HepG-2細胞以及乏氧HepG-2細胞的IC50值，并計算其耐藥倍數(shù)（耐藥細胞組的IC50/敏

2、感細胞組的IC50）；MTT法測定白花蛇舌草作用于乏氧HepG-2細胞后對阿霉素的IC50值，并計算其耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（未加逆轉(zhuǎn)劑組的IC50/加逆轉(zhuǎn)劑組的IC50）；流式細胞術(shù)（FCM）檢測細胞的凋亡率；Western Blot檢測細胞內(nèi)HIF-1a、P-gp及MRP蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1.含100 umol/L的CoCl2培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG-2細胞可建立乏氧HepG-2細胞模型。
　　用0-200umol/L

3、不同濃度的CoCl2作用于HepG-2細胞4天，100umol/L以上濃度的CoCl2在培養(yǎng)至第3天時可使細胞40％以上全部死亡，而小于該濃度則細胞存活率可達到90%。因此，選用細胞最大的耐受劑量100umol/L濃度的CoCl2做為我們后續(xù)實驗的用藥劑量。
　　2. CoCl2誘導(dǎo)的乏氧HepG-2細胞中HIF-1a的表達量增加。
　　Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用100 umol/L的CoCl2建立的乏氧HepG-

4、2細胞中HIF-1a蛋白的表達量明顯高于普通HepG-2細胞(P<0.01)，并且其表達量具有時間依耐性。
　　3.乏氧HepG-2細胞對比普通HepG-2細胞無明顯形態(tài)學(xué)改變。
　　將分別用普通培養(yǎng)基和含100umol/L的CoCl2培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時后所得的HepG-2細胞和乏氧HepG-2細胞，進行瑞氏-吉姆薩染色，置于倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，兩種細胞之間并無明顯形態(tài)學(xué)差異。
　　4.白花蛇舌草對乏氧HepG-2細

5、胞的最大無毒劑量。
　　設(shè)置25、50、75----250mg/L共10個白花蛇舌草濃度梯度分別作用于乏氧HepG-2細胞，采用MTT法計算白花蛇舌草對乏氧HepG-2細胞的抑制率，并繪制出濃度作用曲線。選擇對細胞抑制率低于5%的25mg/L（最大無毒劑量）的白花蛇舌草作為后續(xù)實驗濃度。
　　5.白花蛇舌草能夠部分逆轉(zhuǎn)乏氧HepG-2細胞對ADM的耐藥性。
　　5.1、白花蛇舌草能降低乏氧HepG-2細胞對ADM的IC

6、50值。
　　MTT法結(jié)果顯示：ADM作用于乏氧HepG-2細胞48h后的IC50值為19.21±0.32mg/L，明顯高于普通HepG-2細胞的IC50值2.31±0.23mg/L(P<0.001)。而加入白花蛇舌草后IC50值降為7.27±0.41mg/L，對比乏氧HepG-2細胞組有顯著性差異(P<0.01)，耐藥倍數(shù)和逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為8.32倍和2.64倍。說明乏氧HepG-2細胞對ADM具有耐藥性，而白花蛇舌草能夠部分逆轉(zhuǎn)

7、其耐藥性。
　　5.2、白花蛇舌草能夠加重ADM對乏氧HepG-2細胞的毒性作用。
　　2.5 mg/L ADM作用于三組細胞：HepG-2細胞、乏氧HepG-2細胞和白花蛇舌草+乏氧HepG-2細胞48小時，流式細胞儀測得凋亡率分別為58.20±3.76%、10.05±1.25%和25.42±2.34%。說明白花蛇舌草能夠部分逆轉(zhuǎn)乏氧HepG-2細胞對ADM的耐藥性，加重ADM的細胞毒性作用。
　　6.白花蛇舌草逆轉(zhuǎn)

8、乏氧HepG-2細胞對ADM的耐藥性可能與其下調(diào)HIF-1a、P-gp、MRP蛋白的表達有關(guān)。
　　Western-blot結(jié)果顯示乏氧HepG-2細胞對比HepG-2細胞，其HIF-1a、P-gp和MRP蛋白表達量均明顯增加(P<0.01,P<0.01,P<0.001)，而加入白花蛇舌草后，則能明顯減少其蛋白表達量(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。說明HIF-1a、P-gp和MRP蛋白可能參與了乏氧HepG-2細胞對