滿天星異葒草苷對肝星狀細胞NF-κB信號轉導通路的影響.pdf

1、目的：
　　核因子-κB(nuclear transcription factor-kappa B，NF-κB)作為一種廣泛存在體內細胞的核轉錄調節(jié)因子，參與免疫、炎癥及細胞增殖的調控。近年來研究認為抑制NF-κB信號傳導、誘導肝星狀細胞凋亡，是治療肝纖維化的一條重要途徑。本研究基于NF-κB信號通路的調節(jié)，旨在研究滿天星異葒草苷（2″-O-α-L-阿拉伯糖異葒草苷，IOA）對肝星狀細胞增殖、凋亡的調控作用，探討其體外抗肝纖維化的

2、作用機制。
　　方法：
　　本研究采用的肝星狀細胞包括HSC-T6、LX2和7702。細胞分為6組：正常組，IL-1β刺激組，陽性藥組（PDTC組），異葒草苷低、中、高劑量組（IOAL、IOAM、和IOAH組）。采用 MTT法、集落生成法、劃痕實驗、AnnexinⅤ-FITC/PI和AO-EB染色分別檢測細胞增殖、集落形成、遷移、凋亡及細胞周期；酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA法）檢測細胞上清Ⅲ型膠原（Col-Ⅲ）、腫瘤壞死因

3、子-α（TNF-α）和轉化生長因子-β1（TGF-β1）的含量；免疫組化法測細胞核轉錄因子-κB p65（NF-κB p65）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、Ⅲ型膠原（Col-Ⅲ）的表達；RT-PCR法檢測Ⅰ型膠原（Col-I）、Col-Ⅲ、NF-κB p65、核因子κB抑制蛋白α亞基（IκBα）、TGF-β1和TNF-α mRNA的表達；Western blot法檢測磷酸化NF-κB p65（p-p65）、NF-κB p50、Iκ

4、Bα、Col-I、NF-κB核轉位及細胞漿磷酸化IκBα（p-IκBα)、細胞核 NF-κB p65的表達。
　　結果：
　?。?）IOA對細胞增殖、集落形成、遷移、凋亡及細胞周期的影響
　　實驗發(fā)現(xiàn)，IOA對細胞增殖有抑制作用，呈濃度依賴性（P<0.05或P<0.01）。與正常組相比，IL-1β刺激組細胞增殖明顯增加（P<0.01），細胞遷移及集落生成明顯加快、增多，細胞凋亡率、細胞形態(tài)學和細胞周期無明顯改變；經藥物

5、干預后，PDTC與IOAL、IOAM、IOAH均能顯著抑制HSCs增殖、遷移及集落的生成，提高細胞凋亡率，誘導細胞阻滯在G2期，引起細胞形態(tài)學發(fā)生明顯變化（P<0.05或P<0.01）。這些結果表明，IOA能明顯抑制肝星狀細胞的增殖、遷移，促進其凋亡，從細胞水平上證實了IOA抗肝纖維化的機制與抑制肝星狀細胞的增殖活化有關，為其靶向治療肝纖維化提供了實驗依據(jù)。
　?。?）IOA對膠原的影響
　　RT-PCR研究結果顯示，與正常

6、組相比，IL-1β可明顯上調HSC-T6、LX2細胞Col-I和Col-ⅢmRNA的表達（P<0.01）；ELISA試劑盒、免疫組化結果顯示，與正常組相比，IL-1β刺激組細胞Col-Ⅲ合成和分泌明顯增多（P<0.05或P<0.01）；Western blot研究結果顯示，與正常組相比，IL-1β刺激組Col-I的表達顯著提高（P<0.05或P<0.01）。經藥物干預后，PDTC和IOAL、IOAM、IOAH均能顯著下調Col-I和Co

7、l-ⅢmRNA和蛋白的表達，抑制 Col-Ⅲ合成和分泌，降低Col-I含量（P<0.05或P<0.01）。提示，IOA能明顯抑制肝星狀細胞膠原的合成與沉積，抑制ECM生成，是其抗肝纖維化發(fā)生發(fā)展的藥理學基礎。
　?。?）IOA對炎癥因子的抑制作用
　　ELISA試劑盒檢測和實時熒光定量PCR檢測結果表明，IL-1β可顯著上調HSC-T6和LX2細胞TNF-α、TGF-β1的含量和mRNA的表達（P<0.01）。經藥物干預后，

8、PDTC與IOA均能顯著降低TNF-α、TGF-β1的含量，顯著下調HSC-T6細胞 TNF-α、TGF-β1 mRNA的表達（P<0.05或P<0.01）。結果表明，IOA能顯著抑制肝星狀細胞炎癥因子的釋放，減輕炎癥損傷，是其改善肝纖維化的作用機制之一。
　?。?）IOA對基質金屬蛋白酶（MMP-9）的影響
　　免疫組化結果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，IL-1β刺激組HSC-T6、LX2細胞MMP-9蛋白表達明顯提高（P<0.01

9、）。經藥物干預后，PDTC與IOAM、IOAH均能顯著降低MMP-9蛋白表達（P<0.05或P<0.01）。這些數(shù)據(jù)提示，IOA抑制肝星狀細胞膠原的生成與其降低MMP-9的活性有關。
　?。?）IOA對NF-κB信號通路的影響
　　實時熒光定量PCR檢測結果顯示，PDTC與IOA均能顯著下調HSC-T6、LX2細胞NF-κB P65 mRNA的表達，并上調 IκBα mRNA的表達（p<0.01）。Western Blot結

10、果顯示，IL-1β刺激組細胞p-p65、NF-κB p50、細胞漿p-IκBα、細胞核NF-κB p65蛋白表達明顯增加（P<0.01），細胞漿 NF-κB p65和 IκBα表達明顯減低（P<0.05或P<0.01）。經藥物干預后，上述情況得到逆轉。免疫細胞化學染色顯示細胞核內NF-κB p65陽性染色細胞增多濃染，提示 IL-1β可以誘導NF-κB活化；經藥物干預后，PDTC與IOA細胞核內NF-κB p65陽性染色細胞數(shù)減少淡染，

11、核轉位減少，表明IOA可減少細胞核 NF-κB p65表達，阻止NF-κB核轉位，從而抑制NF-κB活化，對NF-κB信號傳導通路有明顯的抑制作用。
　　結論：
　　IOA能抑制 IL-1β誘導的增殖，阻滯細胞于G2期，誘導細胞凋亡，減少膠原的合成和分泌，降低炎癥細胞因子的釋放；IOA可調控基質金屬蛋白酶的水平，抑制IκBα磷酸化、細胞核 NF-κBp65表達和 NF-κB核轉位。這些結果表明，IOA能明顯抑制肝星狀細胞的活