脂多糖對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6細(xì)胞自噬的影響及NF-κB通路在其中的作用.pdf

1、肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是各種致病因素引起慢性肝損傷后最終形成肝硬化的必經(jīng)病理階段，其中肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）的活化、增殖并產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)是關(guān)鍵。研究表明各種肝臟疾病常伴有腸源性?xún)?nèi)毒素血癥，且內(nèi)毒素的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可促進(jìn)HF的發(fā)生與發(fā)展，但其機(jī)制尚不完全清楚。自噬（autophagy）是細(xì)胞自身?yè)p傷或過(guò)剩的結(jié)構(gòu)通過(guò)

2、溶酶體機(jī)制而被分解使之可再利用的過(guò)程，是一種對(duì)細(xì)胞內(nèi)過(guò)剩的、錯(cuò)誤折疊的、損壞的和有害的蛋白進(jìn)行清除和降解的過(guò)程。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明細(xì)胞自噬在HF的發(fā)生及發(fā)展中具有重要作用。核因子-кB（nuclear factor-кB，NF-кB）作為L(zhǎng)PS導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)及HF等過(guò)程中的重要信號(hào)通路之一，是否影響活化的HSCs細(xì)胞自噬也有待闡明。本實(shí)驗(yàn)以大鼠肝星狀細(xì)胞系（HSC-T6）為研究對(duì)象，初步探討LPS對(duì)HSC-T6自噬的影響及可能

3、機(jī)制。
　　第一部分：脂多糖對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6細(xì)胞自噬的影響
　　目的：
　　研究不同濃度及不同培養(yǎng)時(shí)間的LPS對(duì)體外培養(yǎng)的HSC-T6細(xì)胞自噬的影響。
　　方法：
　　(1)體外HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)，劑量效應(yīng)組分別用質(zhì)量濃度0、0.01、0.1、1、10 mg/L的LPS處理HSC-T624 h；時(shí)間效應(yīng)組用濃度為0.1 mg/L的LPS分別處理HSC-T60 h、3 h、6 h、12 h、1

4、8 h、24 h后，Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白LC3Ⅱ及Beclin1含量。
　　(2)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較用Tukey檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　(1)不同質(zhì)量濃度LPS對(duì)HSC-T6自噬的影響。
　　不同質(zhì)量濃度的LPS與HSC-T6共培養(yǎng)24 h后，在LPS質(zhì)量濃度為0.01、0.1 mg/L時(shí)HSC

5、-T6自噬蛋白LC3Ⅱ含量較0 mg/L組相比顯著增加且在LPS濃度為0.1 mg/L時(shí)LC3Ⅱ含量達(dá)到峰值（P<0.05），0.01、0.1、1 mg/L的LPS處理HSC-T6細(xì)胞24 h后，HSC-T6細(xì)胞中Beclin1含量較0 mg/L組顯著增加且在LPS濃度為0.1 mg/L時(shí)Beclin1含量達(dá)到峰值（P<0.05）；在LPS濃度為10 mg/L時(shí)，LC3Ⅱ及Beclin1含量較0 mg/L組顯著較少（P<0.05）。

6、r>　　(2)不同處理時(shí)間的LPS對(duì)HSC-T6自噬的影響。
　　0.1 mg/LLPS處理HSC-T66～18 h時(shí)LC3Ⅱ及Beclin1水平與0 h相比顯著增加，且在LPS處理6 h時(shí)LC3Ⅱ及Beclin1含量達(dá)到峰值(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　LPS促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞自噬且在LPS濃度為0.1 mg/L作用6 h達(dá)到峰值。
　　第二部分：NF-кB通路在LPS誘導(dǎo)的中的大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-

7、T6細(xì)胞自噬中的作用
　　目的：
　　研究NF-кB通路在LPS誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞自噬中的作用。
　　方法：
　　(1)體外HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)，依據(jù)給藥的不同隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS組、PDTC組、LPS+PDTC組、PMA組和LPS+PMA組。
　　(2)Western blot法測(cè)定LC3Ⅱ及Beclin1蛋白含量。
　　(3)免疫熒光法觀(guān)察NF-кB P65細(xì)胞內(nèi)分布情況。
　　(4)

8、比色法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清清羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）含量。
　　(5)ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清層粘蛋白（Laminin，LN）及透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）含量。
　　(6)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較用Tukey檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　(1)經(jīng)PDTC預(yù)處理后，LPS刺激的HSC-T