重組融合蛋白rMBP-NAP的毒理學研究.pdf

1、幽門螺旋桿菌中性粒細胞激活蛋白(Hp-NAP)與大腸桿菌的麥芽糖結合蛋白（MBP）通過基因工程等技術融合得到的新型重組蛋白rMBP-NAP，研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在通過免疫療法治療癌癥和其他與免疫異常相關的疾病時，有一定的效果，因此，重組融合蛋白rMBP-NAP可以作為一種新型的免疫調節(jié)候選藥物。本課題通過一系列試驗，包括rMBP-NAP的急性毒性試驗、rMBP-NAP的90天長期毒性試驗、rMBP-NAP的小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗和鼠傷寒

2、沙門氏菌回復突變試驗，對rMBP-NAP的安全性進行評價。本研究主要包括以下幾個方面：
　?。?）融合蛋白rMBP-NAP的制備
　　將實驗室前期已有的工程菌E.coli TB1(pMAL-c2x-napA)在37℃搖床培養(yǎng)，加入誘導劑IPTG誘導3h產(chǎn)生融合蛋白rMBP-NAP，低溫離心大量收集菌體后進行超聲破碎，取超聲低溫離心后的上清進行SDS-PAGE蛋白電泳，驗證融合蛋白rMBP-NAP的可溶性，然后采用親和層析方法

3、純化融合蛋白rMBP-NAP，將純化后的蛋白用PBS透析，并采用BCA蛋白定量法和Iamge J2X對純化后的融合蛋白rMBP-NAP分別定量和測定純度。
　　（2）rMBP-NAP的急性毒性試驗
　　根據(jù)預實驗結果，采用最大耐受量法（MTD）對小鼠尾靜脈注射rMBP-NAP。小鼠按照性別隨機分為兩組，其中給藥組20只，PBS陰性對照組10只，給藥組最大給藥劑量125mg/kg是治療劑量的25倍。給藥后連續(xù)觀察7天并做記錄。

4、結果表明直至給藥期結束沒有出現(xiàn)小鼠死亡，給藥期間沒有異常的活動情況。處死小鼠后對小鼠進行解剖并觀察，沒有出現(xiàn)明顯的病變器官。
　?。?）rMBP-NAP的長期毒性試驗
　　根據(jù)預實驗結果，將給大鼠靜脈注射不同劑量的融合蛋白rMBP-NAP。實驗動物隨機分為三組，rMBP-NAP給藥組21mg/kg、42mg/kg和PBS陰性對照組。連續(xù)尾靜脈給藥90天觀察大鼠毒性反應。90天給藥期結束后處死部分大鼠，取血樣和主要器官檢測，其

5、余大鼠在30天恢復期后處死做同樣處理。結果顯示給藥期大鼠體重與對照組相比有明顯差異，血常規(guī)無影響，給藥組的血液生化指標和組織病理學結果顯示，肝、腎可能為毒性靶器官。受試動物在經(jīng)過30天恢復期后各項指標基本恢復正常。
　?。?）rMBP-NAP的小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗
　　隨機將50只昆明鼠分為5組，雌雄各半，分別為陰性PBS對照組，陽性環(huán)磷酰胺對照組，rMBP-NAP給藥組為5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg

6、，連續(xù)5天尾靜脈給藥，末次給藥24h后處死小鼠，制骨髓細胞片染色計數(shù)。結果表明rMBP-NAP給藥組微核率與陰性對照組相比無明顯差異。
　?。?）rMBP-NAP的鼠傷寒沙門氏菌回復突變實驗
　　設計四個劑量受試藥物分別為50μg/每皿、200μg/每皿、1000μg/每皿和4000μg/每皿，均包括加S9和不加S9兩種情況。用測試菌株TA97，TA98，TA100，TA102檢測，結果表明，rMBP-NAP在200~400