毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)

1、毒理學(xué)實驗基礎(chǔ),第一節(jié) 毒理學(xué)實驗的原則與局限性第二節(jié) 毒理學(xué)毒性實驗的基本目的 第三節(jié) 實驗動物 ***第四節(jié) 動物實驗基本方法 ***第五節(jié) 毒理實驗質(zhì)量控制 第六節(jié) 動物實驗的職業(yè)道德,第一節(jié) 毒理學(xué)實驗的原則和局限性,一、毒理學(xué)實驗的基本原則,化學(xué)物在實驗動物產(chǎn)生的作用，可以外推于人。,一、毒理學(xué)實驗的基本原則,2. 動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對人潛在危害的必需和可信的方法。,3. 成年健

2、康（雄性或雌性未孕）實驗動物和人可能的暴露途徑是基本的選擇。選用成年健康實驗動物，是為了使實驗結(jié)果具有代表性和可重復(fù)性。,二、局限性,實驗動物和人對外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感性不同，有時甚至存在質(zhì)的差別。,在毒理學(xué)實驗中，為了尋找毒作用的靶器官，并能在相對少量的動物上就能得到劑量-反應(yīng)或劑量-效應(yīng)關(guān)系，往往選用較大的染毒劑量。,毒理學(xué)實驗所選用的實驗動物數(shù)量有限，那些發(fā)生率很低的毒性反應(yīng)，在少量動物中難以發(fā)現(xiàn)。,實驗動物一般都是實驗室培育的品

3、系，一般選用成年健康動物，反應(yīng)較單一。,第二節(jié) 毒理學(xué)實驗的目的,二、 毒性評價或安全性評價方面的其他目的,毒作用的敏感檢測指標，生物標志物。 毒作用機制研究。 受試物的毒物動力學(xué)和代謝研究。 中毒的解救措施。,第三節(jié)** 實驗動物（laboratory animal）,一、概述,實驗動物：以科學(xué)研究為目的而進行科學(xué)飼養(yǎng)和繁殖的動物。,一、概述,花費人力、物力較少，時間短，容易發(fā)現(xiàn)單因素與結(jié)果的關(guān)系。 能提供大量有價

4、值的可與人類生命活動現(xiàn)象相類比的資料。 以保護人類健康來講，需從動物身上安全，再推到人，避免對人直接損傷。,優(yōu)點：,種類：常用大、小鼠，家兔和豚鼠； 有時用狗、貓、雞和猴等。,常用實驗動物的生物學(xué)和生理學(xué)指標,1.小白鼠,常用實驗動物的生物學(xué)和生理學(xué)指標,常用實驗動物的生物學(xué)和生理學(xué)指標,2.大白鼠,常用實驗動物的生物學(xué)和生理學(xué)指標,常用實驗動物的生物學(xué)和生理學(xué)指標,3.家兔,常用實驗動物的生物學(xué)和生理學(xué)指標

5、,4.豚鼠,常用實驗動物的生物學(xué)和生理學(xué)指標,常用實驗動物的生物學(xué)和生理學(xué)指標,常用實驗動物的生物學(xué)和生理學(xué)指標,,6.狗,5.地鼠,二、實驗動物的選擇,（一）基本原則,1. 動物對受試化學(xué)物比較敏感。2. 實驗動物對受試化學(xué)物的代謝方式盡可能與人接近。3. 經(jīng)濟、易獲得。4. 容易飼養(yǎng)和進行實驗處理。5. 自然壽命不要太長。,常用大、小鼠。,（二）種屬選擇,種屬差異，不同實驗不同毒物選不同種屬動物1. 氣體、蒸汽的粘膜刺激：

6、貓2. 皮膚局部刺激：豚鼠、家兔3. 過敏反應(yīng)：首選豚鼠。 不同動物的致敏順序：豚鼠>家兔>狗>小鼠>貓>青蛙,4. 實質(zhì)性臟器損害：大、小鼠5. 嘔吐反應(yīng)：貓、狗（草食動物兔、豚鼠不嘔吐）6. 發(fā)熱：兔、有時貓；大、小鼠不穩(wěn)7. 血壓：狗、大鼠、家兔,8. 致癌：大、小鼠9. 致畸：大、小鼠10.苯胺及衍生物致變性血紅蛋白作用：狗貓（肉食） 黃曲酶毒素急性毒性：鴨雛 黃曲

7、酶毒素致癌：鱒魚 遲發(fā)性神經(jīng)毒性：母雞,不同的繁育方式可得到不同的實驗動物： 品系（strain): 是實驗動物學(xué)的專有名詞，指用計劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一群動物。,（三）動物繁育方式的選擇,純系動物（近交系，inbred strain） 是連續(xù)“兄妹”及親系交配達20代以上的品系，純合性可高達98.6%，基因穩(wěn)定，遺傳性質(zhì)一致。優(yōu)點：個體差異小，對毒物敏感一致，重現(xiàn)性好；缺點：體弱多病，生殖能力低。

8、,雜交一代（F1 hybrid） 是有目的的選擇兩個不同近交系進行雜交而產(chǎn)生的第一代。 特點：雜交一代的個體間在遺傳上一致，但又不是近親，起表現(xiàn)型的變異頻率比較低，體質(zhì)健壯。,遠交群（outbred colony），封閉群（closed colony）： 為避免近親交配造成的生殖能力低，體質(zhì)差等近親衰退現(xiàn)象，有意識的將一個品系的動物減少近親交配所繁殖的動物稱為該品系的遠交群。 如果遠交群中連續(xù)5年不引進外來動物

9、，即為封閉群。 特點：遠交群以及封閉群動物的遺傳均一性比近交系差，但封閉群比遠交群好。,（四）微生物學(xué)等級標準選擇,目前國際上通過微生物學(xué)監(jiān)察手段，按對動物控制的凈化程度，把實驗動物分為四類，即：Ⅰ級：普通動物（conventional animal , CV）Ⅱ級：清潔動物（clean animal , CL）Ⅲ級：無特定病原體動物（specific pathogen-free, SPF）Ⅳ級：無菌動物（germ f

10、ree animal, GF）,實驗動物設(shè)施的分類,開放系統(tǒng)（open system): 飼育環(huán)境與外界相同，有強力通風(fēng)設(shè)施，飼料、飲水和墊料要求不被污染，應(yīng)有防鼠和防昆蟲設(shè)施。,2. 屏蔽系統(tǒng)（barrier system):飼育環(huán)境是密閉的。送入的空氣需經(jīng)過濾，飼料、飲水和墊料要需經(jīng)過滅菌，飼養(yǎng)人員要經(jīng)過淋浴、穿無菌工作服、戴口罩、手套。,3. 隔離系統(tǒng)（isolation system): 是以一個隔離器為主體，其他客觀存在

11、附屬裝置組成的飼養(yǎng)系統(tǒng)，送入全新風(fēng)要經(jīng)過濾，一切物品都要經(jīng)過嚴格滅菌后經(jīng)傳遞倉送入，飼養(yǎng)人員不得入內(nèi)。,（四）微生物學(xué)等級標準選擇,1.普通動物（conventional animal CV） 要求不帶有人獸共患的病原體及體外寄生蟲。 是實驗動物中在微生物控制上要求最低的動物。飼養(yǎng)在開放系統(tǒng)的動物室內(nèi)。空氣未凈化、喂飼全價顆粒飼料，可飲自來水。房舍要求有防鼠和防止昆蟲進入的設(shè)施。人員進入要穿工作服，專用鞋帽。,2.清潔動物（cl

12、ean animal CL） 在上述基礎(chǔ)上還需不帶有動物傳染病的病原體。 飼養(yǎng)在屏蔽系統(tǒng)中，空氣要經(jīng)過凈化，飼養(yǎng)室要保持正壓，進入室內(nèi)的一切物品要經(jīng)過消毒滅菌，工作人員進入要洗澡和穿滅菌工作服，動物飲用滅菌水。,3.無特定病原體動物（specific pathogen-free，SPF）要求在以上基礎(chǔ)上還需不帶有干擾實驗的微生物。飼養(yǎng)在屏蔽或隔離系統(tǒng)中，是通過無菌動物、悉生動物的。籠具、飼料水要經(jīng)過特殊處理，并要有嚴格檢疫

13、、消毒和隔離制度。,4.無菌動物（germ free animal，GF） 要求不帶有任何用現(xiàn)代方法可檢出的微生物。 此種動物在自然界中并不存在，是在隔離器中經(jīng)人工剖宮產(chǎn)取得仔體，用無菌母體代替人工哺乳，經(jīng)凈化培育得到。,5.悉生動物（gnotobiotic animal，GN） 要求無菌動物中植入一種或幾種已知微生物。,實驗動物微生物等級標準,（五）個體選擇1.年齡、體重2.性別3.生理狀況4.健康狀況（健康動物

14、的標志）,1)發(fā)育正常、體態(tài)豐滿、外觀無畸形；2)被毛濃密、貼順有光澤、不蓬亂；3)胸闊寬闊、脊柱不弓不彎；4)眼睛明亮；5)表皮無潰瘍、無結(jié)痂（注意尾巴）；6)各天然孔干凈、無分泌物；7)行動靈活、反應(yīng)敏捷。,健康狀況（健康動物的標志）,三、實驗動物的飼養(yǎng)和管理,（一）動物室：面積 地面天花板墻壁 溫、濕度（20-26℃；5

15、0-70%） 噪聲（<60dB) 氨濃度（<20ppm)（二）籠具（三）飼養(yǎng)（四）衛(wèi)生管理,四、實驗動物常見疾病,（一）大鼠和小鼠鼠傷寒、敗血癥、傳染性卡他、脫腳病、化膿性中耳炎、癩皮病。（二）豚鼠豚鼠瘟、傳染性肺炎、腹瀉、壞血病。,第四節(jié)** 動物實驗基本方法,（一）實驗前動物應(yīng)♂♀分開飼養(yǎng)。（二）實驗前動物應(yīng)檢疫一周，剔除不健康動物。,一、動物實驗

16、前準備,二、正式實驗,（一）實驗動物稱重、標記、分組,1. 稱重2. 標記染色法用不同的顏色在動物身體的不同部位標色，代表不同的號碼。黃色——苦味酸飽和溶液 個位紅色——品紅酒精飽和溶液 十位耳緣剪口法號牌法,,二、正式實驗,（一）實驗動物稱重、標記、分組,,3. 分組 原則要求所有動物分配到各組的機會均等，避免主觀選擇傾向，使動物試驗減少偏性結(jié)果準確可靠。 （1）抽簽法 （2）隨機數(shù)

17、字表：完全隨機和隨機區(qū)組；具體參照統(tǒng)計學(xué)方法。,染毒（administration exposure）為研究受試化學(xué)物對實驗動物的毒性作用，模擬人體的主要接觸途徑將受試物經(jīng)過某種途徑進入動物體內(nèi)，這種過程叫做染毒。,二、正式實驗,（二）染毒方法,1. 染毒前準備,受試物的準備： 了解受試物的一般情況，如與人接觸的機會、方式和量等。 了解受試物的純度和雜質(zhì)成分； 了解受試物的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，如分子量、比重、溶解度、揮發(fā)性、沸點

18、、熔點和批號等； 用同一種，同一批號的受試物，一次備齊全部實驗用量； 按選用的染毒途徑不同，將受試物配成一定的劑型。,1. 染毒前準備,溶劑或助溶劑的選擇： 所有溶劑或助溶劑均應(yīng)無毒； 與受試物不起反應(yīng)，受試物在溶液中穩(wěn)定； 不影響毒物的吸收，（不妨礙或促進）；,1. 染毒前準備,劑型的選擇： 喂飼法要求受試物無特殊氣味或味道，性質(zhì)應(yīng)比較穩(wěn)定，不容易分解氧化； 灌胃法要求為液體，并且無明顯的局部損傷或刺激作用；

19、 靜脈注射法一般用水溶液，不能用油溶液或混懸液； 腹腔注射法不能用混懸液以免引起腹腔臟器粘連； 呼吸道染毒要求受試物在染毒柜中能均勻穩(wěn)定分布的氣體； 經(jīng)皮染毒要求為液體、膏狀或糊狀。,2. 各種染毒途徑,經(jīng)口染毒 經(jīng)呼吸道染毒 經(jīng)皮染毒 注射途徑,2. 各種染毒途徑：經(jīng)口染毒,灌胃 喂飼 膠囊吞服,2. 各種染毒途徑：經(jīng)呼吸道染毒,定義：在一定容積的密閉容器內(nèi)，加入一定量的毒物使之揮發(fā)并與容器內(nèi)空氣充分混合，均

20、勻分布，形成一定濃度的含毒空氣環(huán)境，放入毒物，在規(guī)定的時間內(nèi)觀察動物的毒性反應(yīng)。,靜式吸入染毒,染毒裝置：一般采用特制的機玻璃染毒柜或大的玻璃瓶。,注意事項：a.液態(tài)受試物不能滴漏到染毒柜底，以防粘上動物皮膚被動物舔食。b.設(shè)計的最高染毒濃度不能超過該受試物的蒸氣飽和濃度，以免受試物蒸發(fā)不全而達不到設(shè)計要求。,動式吸入染毒,定義：是采用機械通風(fēng)裝置，連續(xù)地將新鮮空氣和毒物送入染毒柜，并排出等量的污染空氣，使染毒濃度相對穩(wěn)定。,染毒裝

21、置：由三部分組成 a.染毒柜 b.機械通風(fēng)系統(tǒng) c.配氣系統(tǒng),靜態(tài)染毒柜,動態(tài)染毒柜,靜式染毒與動式染毒的優(yōu)缺點比較,2. 各種染毒途徑：經(jīng)皮膚染毒,１）備皮：機械脫毛、化學(xué)脫毛 脫毛區(qū)＜體表面積15%?。玻┤径痉椒ā　　　〗病　　　⊥科?2. 各種染毒途徑：經(jīng)注射途徑,腹腔注射； 肌肉注射； 靜脈注射； 皮下注射；,（三）生物

22、材料的采集,1. 血液的采集,剪尾采血； 眼眶靜脈叢采血； 眼球摘除采血； 斷頭采血； 心臟采血； 股動脈采血； 耳緣靜脈采血； 腹主動脈采血；,（三）生物材料的采集,2. 尿液和糞便的采集,代謝籠,第五節(jié) 毒理學(xué)實驗質(zhì)量控制,人事方面。實驗動物。實驗儀器和設(shè)備。實驗應(yīng)有嚴格的標準化操作程序和要求。受試物的完整資料。實驗記錄。實驗室工作人員。,GLP：good laboratory prac

23、tice 優(yōu)良實驗研究規(guī)范SOP：standard operating procedure 標準操作方法,第六節(jié) 動物實驗的職業(yè)道德,3R原則（Replace；Reduction；Refinement）替代（Replace）：應(yīng)用無知覺材料的科學(xué)方法來代替使用活的有知覺脊椎動物的方法；減少（Reduction）：是指在能夠保證獲取一定數(shù)量與精確度的數(shù)量信息的前提下，減少動物的使用數(shù)量；優(yōu)化（Refinement）：在必須使