鐵結(jié)合蛋白進化分析，乳酸菌表面展示系統(tǒng)構(gòu)建和產(chǎn)乙醇耐受性研究.pdf

1、鐵作為生物有機體中必需的微量元素之一，在細胞代謝和生物生長發(fā)育中起著重要的作用，比如，體內(nèi)氧的運輸，電子的傳遞，細胞分化和細胞增殖，但是，機體內(nèi)鐵過量會導致機體內(nèi)自由基提升，從而引起蛋白和DNA的氧化損害，造成細胞和組織的死亡。生物體內(nèi)維持鐵平衡的蛋白家族主要是鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白家族，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白家族中的乳鐵蛋白同時作為抗菌活性肽在機體的免疫方面起著至關(guān)重要的作用。本研究從了解鐵蛋白家族和轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的進化及乳鐵蛋白在家族進化過程中的產(chǎn)生

2、和地位入手，將乳鐵蛋白作為抗菌活性肽在食品級乳酸菌中進行表面表達，以期獲得能夠應(yīng)用于飼料添加劑的高效活性益生菌，同時還對乳酸菌作為產(chǎn)乙醇菌耐受木質(zhì)纖維水解液抑制物進行了探索。主要研究結(jié)果如下:
　　1.鐵蛋白家族的進化
　　鐵蛋白家族成員廣泛分布在生物界中，而最典型的鐵蛋白作為看家基因，在動物、植物和微生物界都有發(fā)現(xiàn)。本試驗選取了248個來自病毒、古菌、細菌和真核生物的1181條蛋白序列進行研究，研究發(fā)現(xiàn)鐵蛋白基因在哺乳動物

3、和雙子葉植物中大量存在，真菌中由于有其它鐵平衡系統(tǒng)而很少存在，細菌、古菌中的鐵蛋白基因也很可觀;其中在原核生物中有3中類型的鐵蛋白亞家族存在，而在真核生物中，只有典型的鐵蛋白亞家族存在，但是它是由多種類型的亞基組成;特征序列模體的分析表明，維持鐵結(jié)合和釋放功能的氨基酸殘基位點在生物進化中是保守存在的，同時每個亞家族和亞基類型的特征序列模體是可區(qū)分的，特別是在植物鐵蛋白中發(fā)現(xiàn)了一個辨識度很高的特征模體;鐵蛋白家族的系統(tǒng)進化樹表明，相同亞家

4、族或亞基的鐵蛋白成員在進化樹上是簇成一個進化分支的，不同的亞家族或亞基產(chǎn)生的主要原因是基因復制事件的發(fā)生，同時基因漂移和基因丟失也是產(chǎn)生家族新成員的因素。
　　2.轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的進化
　　轉(zhuǎn)鐵蛋白家族作為轉(zhuǎn)運鐵離子維持鐵平衡的重要蛋白家族主要存在于動物中，同時在綠藻中也有發(fā)現(xiàn)。本試驗選取了具有代表性的動植物的100個物種，共371條轉(zhuǎn)鐵蛋白基因進行研究。研究表明，轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)基因在動物中廣泛分布，但是其基因數(shù)目和類型在不同的

5、動物分類族群中有很大的區(qū)別。一般說來，哺乳動物中基因組中有大量的轉(zhuǎn)鐵蛋白基因，而吸蟲類動物僅少數(shù)的基因存在。其中，黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白（Melanotransferrin）和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(Serotransferrin)廣泛分布于脊椎動物，而類黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白（Melanotransferrin-like）和Ⅰ型類轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin-like1)在所選非脊椎動物各物種中都有分布。本研究從少數(shù)幾個植物物種的基因組中首次推斷出轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)

6、基因的存在，其分布在被子植物和蕨類植物中。通過比較其中6個重要家族成員的一級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)7個高度保守的特征模體。進化樹的構(gòu)建表明，基因復制、基因丟失以及基因漂移是推動轉(zhuǎn)鐵蛋白家族成員多樣性的重要原因，同時，本試驗提出各家族成員可能經(jīng)歷的進化事件。綜上所述，本研究的發(fā)現(xiàn)有助于更全面深入地了解轉(zhuǎn)鐵蛋白家族基因的分布、特征模體和殘基，及其家族的進化進程。
　　3.乳鐵蛋白在食品級乳酸菌中的表面表達
　　以乳鐵蛋白N端活性肽為目的基因，

7、自溶素基因（acmA）作為細胞表面錨定結(jié)構(gòu)域，抗菌肽基因nisⅠ作為食品級篩選標記基因，利用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建了pMG36-acmA-bLfcin-nisⅠ穿梭表達載體，并將其電轉(zhuǎn)化進入食品級乳酸乳球菌MG1614中，成功獲得陽性轉(zhuǎn)化子，通過測序結(jié)果證明成功構(gòu)建了含有表面錨定基因和食品級抗性基因的能高效表達乳鐵蛋白N端多肽的食品級乳酸乳桿菌MG1614(pMG36-acmA-bLfcin-nisⅠ)。
　　4.Lactobac

8、illus casei12AE1在合成水解液中發(fā)酵時對抑制物耐受性研究
　　乳酸菌作為食品級菌株是酒精發(fā)酵生產(chǎn)中常見的易染菌，說明它耐受高濃度酒精、耐受水解液中pH的變化?；贚.casei12AE1的酒精耐受性（＞10％的酒精濃度），碳源利用性和相對較高的電轉(zhuǎn)化效率，本研究主要對水解液中存在的抑制物因子對其發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響進行了探討。研究表明，乳酸乳球工程菌L.casei12AE1具有更好的木質(zhì)纖維素抑制物耐受性;木質(zhì)毒素作為