新型乳酸菌表面展示系統(tǒng)的構建及其潛在應用研究.pdf

1、山東大學博士學位論文新型乳酸菌表面展示系統(tǒng)的構建及其潛在應用研究姓名：胡淑敏申請學位級別：博士專業(yè)：發(fā)酵工程指導教師：孔健20110419山東大學博士學位論文56kDa的表層蛋白。根據(jù)已報道的S層蛋白基因序列設計引物，擴增得到菌株K243表層蛋白的保守序列：再根據(jù)保守序列設計引物，利用LigationanchoredPCR擴增獲得菌株K243表層蛋白基因(s邶)的全長序列，大小為1，323bp，編碼440個氨基酸，經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn)與

2、如c幻6口cf批cr啪忽岱的S層蛋白同源性達95％。2利用s層蛋白細胞壁錨定域構建乳酸菌表面展示體系及靶向表達系統(tǒng)在芽孢桿菌中已成功利用S層蛋白將目的蛋白展示在細胞表面，但乳桿菌中這部分的研究相對較少，因此本文探討和分析S層蛋白作為乳酸菌錨定基序的潛在應用價值。序列分析發(fā)現(xiàn)三6∥卸以f淞lQ43表層蛋白(S1pB)的C端序列(LcsB)和￡6口cf如礎f，淞及三及c，卸口舭，表層蛋白的細胞壁錨定結構域有高度同源性，暗示LcsB可作為乳酸

3、菌表面展示外源蛋白的分子載體。為了驗證LcsB作為錨定基序構建乳酸菌表面展示系統(tǒng)的可行性，本文將綠色熒光蛋白基因(g彥)和zc姐基因進行融合，構建大腸桿菌融合表達載體pETg邱1csB，并導入到大腸桿菌中表達融合蛋白GFPLcsB。將純化后的融合蛋白與不同乳酸菌細胞孵育后，熒光顯微鏡觀察在三6如舾MPc砌、工66陀協(xié)、三6五P～e“c淞、三及joh琊omi、Lbcnspn譏S、SlreptococcHsthermophilus、Lnct

4、ococ懈tactis幫Lbs口廳Ⅷ一淞細胞表面均具有GFP綠色熒光，表明在LcsB引導下GFP蛋白被展示在乳酸菌細胞表面。為闡明LcsB在乳酸菌細胞壁上的作用位點，對乳酸菌細胞做不同預處理，分析不同處理對GFPLcsB結合能力的影響，結果表明SDS處理可以提高GFPLcsB的結合能力，而TCA處理降低GFPLcsB在三6如脅Mec砌細胞表面的結合量，表明LcsB在細胞壁表面的結合位點是磷壁酸，每個細胞大約結合107個GFPLcsB蛋白