孕激素上調(diào)poFUT1基因表達及促進胚胎增殖與黏附機制的研究.pdf

1、背景與目的：
　　孕激素（Progesterone，P）在胚胎發(fā)育成熟和著床過程中起重要作用，孕激素不足可導致胚胎發(fā)育不良，及妊娠終止引起流產(chǎn)。孕激素通過調(diào)節(jié)與著床有關分子的表達促進胚胎的增殖和黏附能力。多種病理和生理過程受到蛋白質(zhì)糖基化的影響，其中包括了胚胎發(fā)育與著床過程。O-糖基化和 N-糖基化是蛋白質(zhì)糖基化的主要形式。蛋白質(zhì)的O-巖藻糖基化受蛋白質(zhì)O-巖藻糖基轉移酶（poFUTs，protein-fucosyltransfe

2、rases）的催化，而poFUTs在促進胚胎發(fā)育與著床過程中的作用未見報道。激活蛋白-1（AP-1)是一種轉錄因子，轉錄因子家族由Jun和Fos的細胞同源物組成，參與細胞增殖、分化、和侵襲過程和內(nèi)分泌基因的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，AP-1（c-Jun/c-Fos）廣泛表達于人胎盤中，活化的AP-1具有調(diào)控胎盤的形成和胎兒發(fā)育的作用。本研究擬探討孕激素對蛋白質(zhì) O-巖藻糖基化的調(diào)控作用及影響胚胎增殖和著床過程。研究結果表明 JAR細胞經(jīng)孕激素作用

3、，增加AP-1（c-Jun/c-Fos）的磷酸化表達，上調(diào)poFUT1的基因表達，并促進胚胎細胞的黏附能力與增殖能力。實驗有助于揭示巖藻糖在著床糖生殖生物學中的作用及其機制，為臨床醫(yī)學提供研究及診斷治療的新思路。
　　方法：
　　1.利用ELISA和Western blot檢測健康未孕、早孕和流產(chǎn)婦女血清中孕激素和poFUT1的蛋白表達水平。通過免疫熒光的方法驗證人絨毛組織中poF UT1的定位和表達。
　　2.利用W

4、ester n blot，免疫熒光和Real-ti me PCR等方法，觀察孕激素對胚胎滋養(yǎng)層細胞中poFUT1基因和蛋白表達水平的影響，以及孕激素與米非司酮聯(lián)合應用對poFUT1基因和蛋白表達水平的影響。
　　3.利用Wester n blot，免疫熒光和Real-ti me PCR等方法，觀察孕激素影響poFUT1的表達及對細胞增殖黏附功能的改變。
　　4.為了探討孕激素是如何調(diào)控poFUT1表達，我們采用Western

5、 blot、EMSA和免疫熒光方法確定孕激素可激活轉錄因子AP-1的轉錄活性。
　　5.利用染色質(zhì)免疫沉淀技術檢測轉錄因子AP-1直接作用在poF UT1的啟動子區(qū)域，促進poFUT1轉錄，并且通過Western blot和Real-time PCR檢測瞬時轉染c-Jun/c-Fos siRNA干擾質(zhì)粒和AP-1抑制劑（TIIA）處理后poFUT1基因和蛋白表達的變化。
　　6.體外著床模型是在熒光顯微鏡下，觀察和統(tǒng)計黏附率

6、，檢測了包括正常組、孕激素組、孕激素聯(lián)合米非司酮組、轉染 c-Jun/c-Fos siRNA干擾質(zhì)粒組，AP-1抑制劑（TIIA）組以及分別聯(lián)合孕激素等9組的胚胎黏附率。并且利用Western blot、免疫熒光和CCK-8檢測JAR細胞增殖能力。
　　結果：
　　1.收集臨床樣品包括健康未孕、正常早孕和先兆流產(chǎn)女性血清進行 ELISA檢測發(fā)現(xiàn)：正常早孕婦女血清中，孕激素和poF UT1的含量均高于先兆流產(chǎn)患者和健康未孕的女

7、性；而先兆流產(chǎn)患者血清中，孕激素和poF UT1的含量比早孕婦女低。孕激素和poF UT1在血清中的表達變化呈正相關。通過免疫熒光確定人早孕絨毛中poFUT1的定位和表達。
　　2.孕激素促進 poFUT1的基因和蛋白水平的表達。經(jīng)過不同濃度的孕激素和不同作用時間處理后，通過Real-time PCR和Western blot等方法檢測發(fā)現(xiàn)，孕激素能顯著促進JAR細胞 poFUT1基因和蛋白的表達；Real-time PCR、We

8、stern blot和免疫熒光結果表明，聯(lián)合應用米非司酮（RU486）可抑制孕激素的效用；瞬時轉染poFUT1 siRNA后，poFUT1表達明顯降低，聯(lián)合孕激素處理后可回調(diào)poFUT1的表達。
　　3.孕激素促進 poFUT1的表達并調(diào)節(jié) JAR細胞的增殖與黏附的能力。Real-time PCR、Western blot和免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)，干擾poFUT1的JAR細胞中合并應用孕激素可以恢復poFUT1的表達。通過Western

9、 blot、CCK-8和免疫熒光等方法分析發(fā)現(xiàn)孕激素調(diào)控poFUT1的表達影響JAR細胞的增殖和黏附能力。
　　4.孕激素激活轉錄因子AP-1的轉錄活性。Wester n blot、EMSA和免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)，孕激素（10-5mol/L）可上調(diào)轉錄因子AP-1(c-Jun/c-Fos)的表達水平，并促進其在核中的積累。
　　5. AP-1直接影響靶基因poFUT1的轉錄，Real-time PCR、Western blot結

10、果顯示，與對照組相比，抑制了AP-1的轉錄激活能力可降低poF UT1的表達水平。通過CHIP實驗進一步確定了AP-1直接作用在poFUT1啟動子區(qū)域，引起下游靶基因poFUT1轉錄并調(diào)控其表達變化。
　　6.孕激素通過激活轉錄因子 AP-1上調(diào) poF UT1表達水平。孕激素可調(diào)控poFUT1的表達，poFUT1的表達變化可影響胚胎細胞增殖能力。通過 Western blot、CCK-8和免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，孕激素能

11、提高JAR細胞的增殖能力；c-Jun/c-Fos siRNA能降低JAR細胞的增殖能力；聯(lián)合孕激素處理可一定程度的回調(diào)由c-Jun/c-Fos siRNA引起JAR細胞增殖能力降低的現(xiàn)象；同時，孕激素也能夠回調(diào)由AP-1抑制劑（TIIA）引起J AR細胞低的增殖能力；研究發(fā)現(xiàn)，孕激素可提高胚胎細胞的增殖能力。
　　7.利用體外黏附模型，觀察胚胎細胞的體外黏附率。孕激素可提高JAR細胞的黏附率；瞬時轉染c-Jun/c-Fos siR

12、NA干擾質(zhì)粒可降低JAR細胞的黏附率；同時，孕激素能夠恢復c-Jun/c-Fos siRNA預處理的JAR細胞的低黏附率；孕激素也能夠恢復預處理AP-1抑制劑TIIA的JAR細胞低黏附率；進一步的研究發(fā)現(xiàn)孕激素可恢復 poFUT1 siRNA導致的胚胎較低的黏附率。孕激素通過促進poFUT1的表達提高了胚胎的黏附能力。
　　結論：
　　1.正常早孕時期女性血清中孕激素和 poFUT1的含量較先兆流產(chǎn)患者高，且呈正相關性。人絨