孕激素上調(diào)poFUT1基因表達(dá)及促進(jìn)胚胎增殖與黏附機(jī)制的研究.pdf

1、背景與目的：
　　孕激素（Progesterone，P）在胚胎發(fā)育成熟和著床過程中起重要作用，孕激素不足可導(dǎo)致胚胎發(fā)育不良，及妊娠終止引起流產(chǎn)。孕激素通過調(diào)節(jié)與著床有關(guān)分子的表達(dá)促進(jìn)胚胎的增殖和黏附能力。多種病理和生理過程受到蛋白質(zhì)糖基化的影響，其中包括了胚胎發(fā)育與著床過程。O-糖基化和 N-糖基化是蛋白質(zhì)糖基化的主要形式。蛋白質(zhì)的O-巖藻糖基化受蛋白質(zhì)O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（poFUTs，protein-fucosyltransfe

2、rases）的催化，而poFUTs在促進(jìn)胚胎發(fā)育與著床過程中的作用未見報(bào)道。激活蛋白-1（AP-1)是一種轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子家族由Jun和Fos的細(xì)胞同源物組成，參與細(xì)胞增殖、分化、和侵襲過程和內(nèi)分泌基因的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，AP-1（c-Jun/c-Fos）廣泛表達(dá)于人胎盤中，活化的AP-1具有調(diào)控胎盤的形成和胎兒發(fā)育的作用。本研究擬探討孕激素對蛋白質(zhì) O-巖藻糖基化的調(diào)控作用及影響胚胎增殖和著床過程。研究結(jié)果表明 JAR細(xì)胞經(jīng)孕激素作用

3、，增加AP-1（c-Jun/c-Fos）的磷酸化表達(dá)，上調(diào)poFUT1的基因表達(dá)，并促進(jìn)胚胎細(xì)胞的黏附能力與增殖能力。實(shí)驗(yàn)有助于揭示巖藻糖在著床糖生殖生物學(xué)中的作用及其機(jī)制，為臨床醫(yī)學(xué)提供研究及診斷治療的新思路。
　　方法：
　　1.利用ELISA和Western blot檢測健康未孕、早孕和流產(chǎn)婦女血清中孕激素和poFUT1的蛋白表達(dá)水平。通過免疫熒光的方法驗(yàn)證人絨毛組織中poF UT1的定位和表達(dá)。
　　2.利用W

4、ester n blot，免疫熒光和Real-ti me PCR等方法，觀察孕激素對胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞中poFUT1基因和蛋白表達(dá)水平的影響，以及孕激素與米非司酮聯(lián)合應(yīng)用對poFUT1基因和蛋白表達(dá)水平的影響。
　　3.利用Wester n blot，免疫熒光和Real-ti me PCR等方法，觀察孕激素影響poFUT1的表達(dá)及對細(xì)胞增殖黏附功能的改變。
　　4.為了探討孕激素是如何調(diào)控poFUT1表達(dá)，我們采用Western

5、 blot、EMSA和免疫熒光方法確定孕激素可激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1的轉(zhuǎn)錄活性。
　　5.利用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)檢測轉(zhuǎn)錄因子AP-1直接作用在poF UT1的啟動子區(qū)域，促進(jìn)poFUT1轉(zhuǎn)錄，并且通過Western blot和Real-time PCR檢測瞬時(shí)轉(zhuǎn)染c-Jun/c-Fos siRNA干擾質(zhì)粒和AP-1抑制劑（TIIA）處理后poFUT1基因和蛋白表達(dá)的變化。
　　6.體外著床模型是在熒光顯微鏡下，觀察和統(tǒng)計(jì)黏附率

6、，檢測了包括正常組、孕激素組、孕激素聯(lián)合米非司酮組、轉(zhuǎn)染 c-Jun/c-Fos siRNA干擾質(zhì)粒組，AP-1抑制劑（TIIA）組以及分別聯(lián)合孕激素等9組的胚胎黏附率。并且利用Western blot、免疫熒光和CCK-8檢測JAR細(xì)胞增殖能力。
　　結(jié)果：
　　1.收集臨床樣品包括健康未孕、正常早孕和先兆流產(chǎn)女性血清進(jìn)行 ELISA檢測發(fā)現(xiàn)：正常早孕婦女血清中，孕激素和poF UT1的含量均高于先兆流產(chǎn)患者和健康未孕的女

7、性；而先兆流產(chǎn)患者血清中，孕激素和poF UT1的含量比早孕婦女低。孕激素和poF UT1在血清中的表達(dá)變化呈正相關(guān)。通過免疫熒光確定人早孕絨毛中poFUT1的定位和表達(dá)。
　　2.孕激素促進(jìn) poFUT1的基因和蛋白水平的表達(dá)。經(jīng)過不同濃度的孕激素和不同作用時(shí)間處理后，通過Real-time PCR和Western blot等方法檢測發(fā)現(xiàn)，孕激素能顯著促進(jìn)JAR細(xì)胞 poFUT1基因和蛋白的表達(dá)；Real-time PCR、We

8、stern blot和免疫熒光結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用米非司酮（RU486）可抑制孕激素的效用；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染poFUT1 siRNA后，poFUT1表達(dá)明顯降低，聯(lián)合孕激素處理后可回調(diào)poFUT1的表達(dá)。
　　3.孕激素促進(jìn) poFUT1的表達(dá)并調(diào)節(jié) JAR細(xì)胞的增殖與黏附的能力。Real-time PCR、Western blot和免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾poFUT1的JAR細(xì)胞中合并應(yīng)用孕激素可以恢復(fù)poFUT1的表達(dá)。通過Western

9、 blot、CCK-8和免疫熒光等方法分析發(fā)現(xiàn)孕激素調(diào)控poFUT1的表達(dá)影響JAR細(xì)胞的增殖和黏附能力。
　　4.孕激素激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1的轉(zhuǎn)錄活性。Wester n blot、EMSA和免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孕激素（10-5mol/L）可上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子AP-1(c-Jun/c-Fos)的表達(dá)水平，并促進(jìn)其在核中的積累。
　　5. AP-1直接影響靶基因poFUT1的轉(zhuǎn)錄，Real-time PCR、Western blot結(jié)

10、果顯示，與對照組相比，抑制了AP-1的轉(zhuǎn)錄激活能力可降低poF UT1的表達(dá)水平。通過CHIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定了AP-1直接作用在poFUT1啟動子區(qū)域，引起下游靶基因poFUT1轉(zhuǎn)錄并調(diào)控其表達(dá)變化。
　　6.孕激素通過激活轉(zhuǎn)錄因子 AP-1上調(diào) poF UT1表達(dá)水平。孕激素可調(diào)控poFUT1的表達(dá)，poFUT1的表達(dá)變化可影響胚胎細(xì)胞增殖能力。通過 Western blot、CCK-8和免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，孕激素能

11、提高JAR細(xì)胞的增殖能力；c-Jun/c-Fos siRNA能降低JAR細(xì)胞的增殖能力；聯(lián)合孕激素處理可一定程度的回調(diào)由c-Jun/c-Fos siRNA引起JAR細(xì)胞增殖能力降低的現(xiàn)象；同時(shí)，孕激素也能夠回調(diào)由AP-1抑制劑（TIIA）引起J AR細(xì)胞低的增殖能力；研究發(fā)現(xiàn)，孕激素可提高胚胎細(xì)胞的增殖能力。
　　7.利用體外黏附模型，觀察胚胎細(xì)胞的體外黏附率。孕激素可提高JAR細(xì)胞的黏附率；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染c-Jun/c-Fos siR

12、NA干擾質(zhì)?？山档蚃AR細(xì)胞的黏附率；同時(shí)，孕激素能夠恢復(fù)c-Jun/c-Fos siRNA預(yù)處理的JAR細(xì)胞的低黏附率；孕激素也能夠恢復(fù)預(yù)處理AP-1抑制劑TIIA的JAR細(xì)胞低黏附率；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)孕激素可恢復(fù) poFUT1 siRNA導(dǎo)致的胚胎較低的黏附率。孕激素通過促進(jìn)poFUT1的表達(dá)提高了胚胎的黏附能力。
　　結(jié)論：
　　1.正常早孕時(shí)期女性血清中孕激素和 poFUT1的含量較先兆流產(chǎn)患者高，且呈正相關(guān)性。人絨