上調(diào)BTG3基因表達(dá)對食管腺癌增殖侵襲的作用.pdf

1、背景與目的：
　　食管癌是常見惡性腫瘤之一,其主要的組織學(xué)類型是食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）。然而，食管腺癌的發(fā)病率在近幾十年中也有所增加并且該增長趨勢的潛在原因還未完全明了。在所有的實(shí)體腫瘤中，食管癌是預(yù)后最差的腫瘤之一，其五年存活率的患者僅占14％。外科手術(shù)仍為主要的根治方法，但它僅適于少于50%的患者，其原因在于大多數(shù)的食管癌患者在癌癥晚期才被診斷出來。因此，深入探索食管腺癌的分子機(jī)制是提高早期診斷和治療效果的基礎(chǔ)。
　

2、　B細(xì)胞遷移基因3(B cell translocation gene3, BTG3)編碼的蛋白屬于抗惡性細(xì)胞增殖蛋白，在人類細(xì)胞中B細(xì)胞遷移基因(B cell translocation gene)／ErbB2轉(zhuǎn)錄因子(transducer of ErbB2, Tob)家族也包括BTG1、BGT2、ToB、ToB2和PC3b。這些蛋白以氨基酸分子上一段較特異的BTG結(jié)構(gòu)域?yàn)楣餐卣鳎鼈兊腘端有104-106個具有同源性的氨基酸，在各

3、類細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程。BTG／Tob蛋白家族可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制或經(jīng)翻譯后的修飾被激活或抑制。一些研究表明， BTG／Tob蛋白直接參與癌癥中。在肺癌或甲狀腺細(xì)胞癌患者中，頻繁觀察到有磷酸化活性狀態(tài)的Tob1或Tob1的表達(dá)減少參與其中。BTG2的下調(diào)或受損表達(dá)在前列腺癌或乳腺癌的患者中可觀察到。BTG3和一個在細(xì)胞周期進(jìn)程中進(jìn)入S期的重要的轉(zhuǎn)錄因子E2F1相互作用。關(guān)于Tob1，在肺癌樣本中可高頻率的觀察到BTG3的低度表達(dá)。敲除B

4、TG3基因的小鼠，肺癌的發(fā)病率同樣顯示出顯著增高。在腎癌中，通過DNA甲基化作用,使啟動子失活,降低BTG3的表達(dá)。然而，BTG3在食管腺癌中的表達(dá)特性和作用仍不清楚。為此,本項(xiàng)研究設(shè)定了兩個研究目的：明確食管腺癌標(biāo)本中BTG3基因表達(dá)水平；揭示上調(diào)BTG3基因表達(dá)對食管腺癌細(xì)胞增殖、周期、轉(zhuǎn)移的影響。
　　方法:
　　1.收集39例食管腺癌組織及相對應(yīng)的癌旁正常組織手術(shù)標(biāo)本,熒光定量RT-PCR和Western-blot檢

5、測BTG3 mRNA和蛋白表達(dá)水平；并分析BTG3基因表達(dá)水平與食管腺癌標(biāo)本病理學(xué)特征的關(guān)系。
　　2.構(gòu)建BTG3真核表達(dá)載體（pcDNA3.1-BTG3）、轉(zhuǎn)染、篩選得到穩(wěn)定上調(diào)BTG3的食管腺癌OE-33細(xì)胞株。
　　3.通過CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測上調(diào)食管腺癌BTG3基因表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響。
　　4.采用流式細(xì)胞術(shù)和Western-blot檢測上調(diào)食管腺癌BTG3基因表達(dá)對細(xì)胞周期的影響。

6、>　　5.使用流式細(xì)胞術(shù)檢測上調(diào)食管腺癌BTG3基因表達(dá)對細(xì)胞凋亡的作用。
　　6.應(yīng)用Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測上調(diào)食管腺癌BTG3基因表達(dá)對細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。
　　7.采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，單因素方差用于分析多項(xiàng)指標(biāo)間的比較，LSD-t檢驗(yàn)用于比較兩項(xiàng)指標(biāo)間的比較；t檢驗(yàn)用于計(jì)量資料；Spearman相關(guān)分析用于相關(guān)性檢驗(yàn)，以α=0.05為顯著性水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1.熒光定

7、量RT-PCR和Western blot檢測顯示，食管腺癌組織中BTG3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著低于癌旁正常組織中表達(dá)水平（P<0.05）；BTG3 mRNA表達(dá)水平與食管腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和TNM分期有關(guān)（P<0.05），而與其性別、年齡以及腫瘤分化程度無關(guān)（P>0.05）。
　　2. CCK-8實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示：Ex-BTG3組細(xì)胞的增殖能力在轉(zhuǎn)染后2天出現(xiàn)顯著抑制（P<0.05）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：兩周后Ex

8、-BTG3組的細(xì)胞克隆細(xì)胞團(tuán)形成顯著少于NC組（P<0.05）。
　　3.細(xì)胞周期結(jié)果顯示：Ex-BTG3組細(xì)胞G1/G0期細(xì)胞比例較NC組顯著增加（P<0.05），同時S期比例較NC組顯著減少（P<0.05）。Western-blot結(jié)果顯示：Ex-BTG3組細(xì)胞周期蛋白Cyclin A, Cyclin D1的表達(dá)較NC組顯著降低，說明上調(diào)BTG3表達(dá)可減少食管腺癌細(xì)胞分裂期細(xì)胞比例，使細(xì)胞分裂阻滯。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)

9、果顯示：NC組細(xì)胞凋亡率為（7.14±0.91）%，Ex-BTG3組細(xì)胞凋亡率為（16.1±1.92）%。Ex-BTG3組細(xì)胞凋亡率較NC組顯著升高（P＜0.05）。
　　5. Transwell分析結(jié)果顯示：與NC組相比，Ex-BTG3組遷移通過基質(zhì)膠的OE-33細(xì)胞數(shù)均顯著降低（P<0.01）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Ex-BTG3組的細(xì)胞遷移距離顯著低于NC組（P<0.05）。說明BTG3過表達(dá)可抑制食管腺癌細(xì)胞的侵襲能力。