正常人肝10種細(xì)胞色素P450及微粒體蛋白含量、活性研究.pdf

1、細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)是肝臟的主要藥物代謝酶，參與臨床70％～80%常用藥物的代謝，主要包括CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5等10種亞型。CYP代謝藥物活性的不同是臨床藥物反應(yīng)個(gè)體差異的主要原因，主要表現(xiàn)在酶基因多態(tài)性和含量差異性兩個(gè)方面。
　　CYP基因多態(tài)性的研究成果已得到廣泛認(rèn)可，但

2、尚不足以完全解釋藥物的個(gè)體差異。CYP含量差異性是藥物個(gè)體差異的另一重要影響因素，但正常人肝CYP含量的大樣本研究至今尚無(wú)報(bào)道。究其原因，正常人肝標(biāo)本來(lái)源受限和缺乏準(zhǔn)確可靠的定量方法是困擾CYP研究的重要因素。目前，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)發(fā)展迅速，穩(wěn)定同位素稀釋內(nèi)標(biāo)-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)-質(zhì)譜技術(shù)（Multiple Reaction Monitoring coupled with Stable Isotope Dilution Mass S

3、pectrometry，SID-MRM-MS）已成為目前蛋白質(zhì)定量的較為理想的方法。由于缺乏正常人肝CYP含量標(biāo)準(zhǔn)，酶含量差異性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、遺傳及其表觀遺傳學(xué)的調(diào)控機(jī)制尚無(wú)法開(kāi)展系統(tǒng)研究。因此研究正常人肝CYP含量，并探討其轉(zhuǎn)錄調(diào)控及表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步探討藥物代謝酶對(duì)藥物代謝個(gè)體差異的影響，指導(dǎo)臨床個(gè)體化合理用藥，具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　每克肝組織中的微粒體含量（Microsomal Protein Per Gr

4、am of Liver，MPPGL）是影響 CYP代謝個(gè)體差異的另一重要因素，也是生理藥代動(dòng)力學(xué)模型（Physiologically-Based Pharmacokinetics，PBPK)中將藥物體外代謝清除率推至體內(nèi)清除率過(guò)程中的一個(gè)重要校正因子。為了正確地預(yù)測(cè)藥物體內(nèi)的代謝清除率，需準(zhǔn)確測(cè)定MPPGL的含量及含量的個(gè)體差異，至今尚無(wú)大樣本正常人肝微粒體蛋白生理含量的研究報(bào)道。
　　體內(nèi)體外外推（In Vitro-In Viv

5、o Extrapolation，IVIVE)給研究者提供了在研究體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)之前獲得藥物代謝定量數(shù)據(jù)的機(jī)會(huì)。通常，IVIVE時(shí)，用的是各參數(shù)的平均值，只能得到單點(diǎn)的體內(nèi)清除率，常常導(dǎo)致預(yù)測(cè)的偏差。如果用參數(shù)的個(gè)體數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，即可得到體內(nèi)清除率的范圍，降低預(yù)測(cè)的偏差，為臨床提供更加可靠的數(shù)據(jù)。
　　本課題擬以已收集的正常人肝標(biāo)本為研究對(duì)象，采用qPCR的方法，對(duì)107例正常人肝10種CYP的mRNA進(jìn)行定量；采用SID-MRM-

6、MS對(duì)100例正常人肝10種CYPs亞型含量進(jìn)行定量，明確正常生理范圍，發(fā)現(xiàn)個(gè)體差異程度；對(duì)107例正常人肝中調(diào)控CYPs各種亞型的轉(zhuǎn)錄因子及miRNA進(jìn)行定量，從轉(zhuǎn)錄水平及表觀遺傳學(xué)角度闡述影響酶含量的機(jī)制；選用特異性探針，研究10種CYP亞型水平的酶動(dòng)力學(xué)，明晰藥物代謝的個(gè)體差異程度。對(duì)10種CYP亞型進(jìn)行基因分型，明確基因多態(tài)性對(duì)CYP含量及活性的影響，發(fā)現(xiàn)基因型對(duì)個(gè)體差異的影響程度。
　　另外，測(cè)定128例正常人肝MPPG

7、L的含量，明確正常生理范圍，發(fā)現(xiàn)個(gè)體差異程度；測(cè)定10種CYP在微粒體水平與肝臟水平的代謝活性，比較兩種活性之間的差異。另外，用78例樣本MPPGL、CLint等5種參數(shù)個(gè)體數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)CYP2C9探針?biāo)幬锛妆交嵌‰弩w內(nèi)肝清除率的個(gè)體差異，以期為基于 PBPK的體內(nèi)清除率預(yù)測(cè)提供生理參數(shù)。
　　1、方法：
　　1.1人肝標(biāo)本收集128例肝功能正常的人肝組織樣本。其中男性40例，女性88例，平均年齡47.2歲。吸煙或飲酒者各13例

8、。
　　1.2人肝微粒體的制備及微粒體蛋白含量的測(cè)定差速離心法制備人肝微粒體(Human Liver Microsome，HLM)，采用Bradford法測(cè)定微粒體蛋白濃度。
　　1.3 CYP基因多態(tài)性的測(cè)定選擇在中國(guó)漢族人群中基因多態(tài)性發(fā)生頻率在1%以上的位點(diǎn)，對(duì)10種 CYP亞型進(jìn)行基因分型，共25個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，用SNP MassARRAY分型檢測(cè)。
　　1.4熒光定量PCR測(cè)定mRNA及miRNA的表達(dá)將1μg

9、的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，兩步法在7500 Fast Real-Time PCR System進(jìn)行PCR擴(kuò)增。miRNA定量先將1μg的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5倍稀釋后三步法在進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
　　1.5 SID-MRM-MS測(cè)定人肝微粒體CYP亞型蛋白的含量將10種CYP亞型的特異性肽段序列整合在一個(gè)QconCAT蛋白序列中，用大腸桿菌表達(dá)同位素標(biāo)記該蛋白序列，純化后，和待測(cè)樣品一起酶切，脫鹽后Triple TOF56

10、00+質(zhì)譜儀進(jìn)行SID-MRM-MS分析定量。
　　1.610種CYP亞型酶活性的測(cè)定100μl的人肝微粒體孵育體系中分別加入不同濃度的系列CYP的特異性底物、EDTA、磷酸鹽緩沖液、氯化鎂等，37℃預(yù)孵育后加入 NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，后加冰乙腈、乙酸乙酯或高氯酸終止反應(yīng)，用HPLC-UV或HPLC-FLD進(jìn)行分析測(cè)定。
　　1.7 MPPGL含量測(cè)定通過(guò)同時(shí)測(cè)定同一樣品肝勻漿及HLM中的NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶（P

11、OR）的活性計(jì)算MPPGL。MPPGL（mg/g）=每克肝臟POR活性/每毫克HLM的POR活性=nmol Cyt.c min-1 g-1/nmol Cyt.c min-1mg-1
　　1.8甲苯磺丁脲肝清除率的預(yù)測(cè)先將甲苯磺丁脲的體外清除率（CLint,in vitro）轉(zhuǎn)化成整肝清除率（CLint,liver），再用充分?jǐn)嚢枘Ｐ瓦M(jìn)行預(yù)測(cè)，用每一例樣本的5種參數(shù)（MPPGL，CLint，in vitro，LW，QH及BW）數(shù)據(jù)進(jìn)

12、行預(yù)測(cè)，得到體內(nèi)肝清除率的范圍。預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度用AFE(Average Fold-error，平均誤差倍數(shù))判定。
　　1.9統(tǒng)計(jì)方法 SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Prism5.0軟件作圖。因本實(shí)驗(yàn)大部分?jǐn)?shù)據(jù)為非正態(tài)分布，用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、結(jié)果：
　　2.1人肝中10種CYP的表達(dá)
　　2.1.1人肝微粒體中CYP亞型蛋白含量100例正常人肝中10種CYP亞型

13、含量均呈非正態(tài)分布。含量為4.62（CYP2B6）到102.04pmol/mg（CYP2E1）（中位數(shù)），CYP3A4含量個(gè)體差最大，129倍，其它CYP含量差異倍數(shù)為11~100倍。除了7對(duì)CYP之外，其它的CYP亞型蛋白含量之間均有顯著性相關(guān)性(P<0.05)。
　　2.1.210種CYP mRNA的表達(dá)100例正常人肝中10種CYP的mRNA均呈非正態(tài)分布。相對(duì)表達(dá)水平0.19（CYP2D6）到5.94（CYP2E1）（中位

14、數(shù)）。CYP2A6表達(dá)水平個(gè)體差異倍數(shù)最大，168倍，其它 CYP mRNA表達(dá)水平差異倍數(shù)為8~122倍。除了4對(duì)CYP之外，其它的CYP mRNA表達(dá)水平之間均有顯著性相關(guān)性(P<0.05)。
　　2.1.3 CYP mRNA與相應(yīng)蛋白之間的相關(guān)性只有CYP1A2、CYP2A6的mRNA與蛋白含量具有顯著相關(guān)性（P<0.01)。
　　2.2 CYP表達(dá)水平的影響因素
　　2.2.1轉(zhuǎn)錄因子4種轉(zhuǎn)錄因子PXR、HNF

15、4α、CAR及AHR的mRNA水平均呈非正態(tài)分布，表達(dá)水平均較低，但個(gè)體差異較大，從12到85倍。除PXR與AHR之外，其它的轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)水平之間均有顯著相關(guān)性(P<0.05)。
　　除了AHR與CYP2C9、CYP2D6之外，其它的轉(zhuǎn)錄因子與CYP在mRNA表達(dá)水平之間均有顯著性相關(guān)性(P<0.05)。轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá)水平與CYP的蛋白含量之間的相關(guān)性較差。
　　2.2.2 miRNA7種miRNA表達(dá)水平

16、均呈非正態(tài)分布。其中miRNA-27b在肝組織中的表達(dá)豐度最高，miRNA-34a豐度較低。miRNA-27b個(gè)體差異達(dá)618倍，其它 miRNA的差異倍數(shù)為89~312倍。7種 miRNA之間均有顯著性相關(guān)性(P<0.019)。
　　miRNA與CYP的mRNA表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；miRNA與與部分CYP的蛋白含量有顯著相關(guān)性；miRNA與CYP的蛋白翻譯效率無(wú)著性相關(guān)(P>0.05)。
　　2.2.3基

17、因多態(tài)性
　　CYP基因多態(tài)性對(duì) mRNA的影響 CYP1A2-3113A>G、CYP2A6*4、CYP2A6*9、CYP2D6100C>T(*10)、CYP2D61661G>C、CYP3A5 A>G(*3)突變對(duì)mRNA表達(dá)水平有顯著影響（P<0.05）。
　　CYP基因多態(tài)性對(duì)蛋白含量的影響 CYP1A25347C>T、CYP1A22159G>A、CYP2A6*4、CYP2A6*9、CYP2C9*3、CYP2D6*10、

18、CYP2D61661G>C、CYP2E1-1293G>C、CYP2E17632T>A、CYP2E1-333T>A與CYP3A5 A>G突變對(duì)蛋白含量有顯著影響。
　　2.2.4人口學(xué)因素男性組 CYP1A2的mRNA表達(dá)水平顯著高于女性組（P=0.014）；隨著年齡的增加CYP2B6、CYP3A4、CYP2C8、CYP2C9及CYP2C19的mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)；隨著年齡的增加，CYP3A5蛋白含量明顯增加(P<0

19、.05)。
　　2.310種CYP亞型水平活性90例樣本中10種CYP亞型的Vmax、Km和CLint活性均呈非正態(tài)分布。10種CYP Km為1.9~230.4μm/L（中位數(shù)），Vmax為1.2~21 pmol/min/pmolCYP（中位數(shù)），CLint為0.012~10.8μl/min/pmolCYP（中位數(shù)）。10種CYP亞型酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)存在大的個(gè)體差異，Vmax的個(gè)體差異9~1697倍；CLint為23~625倍；Km個(gè)

20、體差異相對(duì)較小，為3~40倍。
　　除 CYP2C19之外，其它的CYP亞型水平 Vmax之間均有顯著性相關(guān)性(P<0.05)。除了CYP2C19與5種CYP，CYP3A5與4種CYP均無(wú)相關(guān)性之外，其它的CYP亞型水平CLint之間均有顯著性相關(guān)性(P<0.05)。10種CYP亞型Km之間的相關(guān)性較差，僅7對(duì)CYP之間有相關(guān)性(P<0.05)。
　　2.4基因多態(tài)性對(duì)10種 CYP亞型水平活性的影響 CYP1A25347C

21、>T、CYP1A22159G>A、CYP2A*4、CYP2A6*9、CYP2D6*10、CYP2D61661G>C及CYP3A5*3對(duì)酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)有顯著影響（P<0.05）。
　　2.5 MPPGL含量128中國(guó)正常人肝樣本的MPPGL呈非正態(tài)分布。MPPGL的平均含量為39.46 mg/g liver，范圍6.71到127.95mg/g liver，個(gè)體差異19倍。性別、年齡、吸煙、飲酒及臨床診斷對(duì)MPPGL含量均無(wú)顯著影響(P

22、>0.05)。
　　2.6 CYP微粒體水平與肝組織水平活性10種CYP微粒體水平的活性（轉(zhuǎn)化速率）31.50~677.94pmol/min/mg protein（中位數(shù)），個(gè)體差異6~232倍。用每個(gè)個(gè)體微粒體水平的活性乘以其相對(duì)應(yīng)的MPPGL的含量，代表每克肝組織水平CYP的活性（轉(zhuǎn)化速率）。肝組織水平CYP活性0.96-29.05 nmol/min/g liver，個(gè)體差異23~210倍。
　　除了CYP2C19之外，

23、肝臟水平CYP活性的個(gè)體差異均高于微粒體水平。9種CYP肝臟水平活性個(gè)體差異的倍數(shù)變化比相對(duì)應(yīng)的微粒體水平活性的個(gè)體差異倍數(shù)分別高18%~278%。與微粒體水平活性相比，肝臟水平的活性在10種CYP中的每一種都有較大的位次改變。CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9和CYP2E1，分別有47%、41%、40%和41%的樣本位次變化幅度超過(guò)20%。
　　2.7甲苯磺丁脲體內(nèi)肝清除率的預(yù)測(cè)7種方法預(yù)測(cè)的甲苯磺丁脲的肝清除率的平均值均

24、為0.113 ml/min/kg，但預(yù)測(cè)范圍區(qū)間則有明顯的差異。方法G為目前通用的預(yù)測(cè)方法，用各種參數(shù)的平均值預(yù)測(cè)，僅僅得到肝清除率的預(yù)測(cè)平均值；本實(shí)驗(yàn)所用的方法A，78例樣本每個(gè)個(gè)體的5種參數(shù)，預(yù)測(cè)出甲苯磺丁脲的肝清除率的變異區(qū)間0.012~0.558 ml/min/kg，個(gè)體差異51倍。
　　3、結(jié)論：
　　1.提供了正常人肝10種CYP亞型蛋白及微粒體蛋白含量的正常值，兩者均有明顯個(gè)體差異。
　　2.提出新的CY