腎透明細胞癌來源的外泌體誘導(dǎo)NK細胞功能發(fā)生缺陷的機制研究.pdf

1、目的：腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是我國常見的泌尿系腫瘤，發(fā)病率高，早期發(fā)現(xiàn)不易。腎透明細胞癌在其發(fā)生、發(fā)展的過程中容易受到腫瘤微環(huán)境中的各種細胞的調(diào)控影響。并且當(dāng)其抗腫瘤免疫反應(yīng)發(fā)生缺陷的時候，腎透明細胞癌患者往往臨床預(yù)后不良。自然殺傷（Natural killer cells,NK）細胞是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在抗腫瘤效應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。本研究目的旨在探索NK

2、細胞在腎細胞癌中免疫應(yīng)答發(fā)生缺陷的機制。
　　方法：
　　1.從腎透明細胞癌患者和對照者中，搜集手術(shù)切除組織和外周血標(biāo)本，采用流式細胞術(shù)檢測NK細胞的頻數(shù)和表型。
　　2.檢測NK細胞殺傷和分泌細胞因子的功能，分析其與腎透明細胞癌進展的關(guān)系。
　　3.培養(yǎng)腫瘤組織、癌旁組織及良性腫瘤旁組織原代細胞，將各組原代細胞與正常NK細胞在transwell小室上進行共孵育，判斷腫瘤細胞與NK細胞細胞間通訊方式。提取細胞外泌

3、體，進行電鏡、WB、外泌體粒徑分布檢測，同時分析其與腎透明細胞癌進展的關(guān)系。將提取的外泌體與NK共孵育測NK細胞的功能。
　　4.分別提取腎癌腫瘤細胞系786-O、正常腎臟上皮細胞HK-2系培養(yǎng)上清中外泌體（exosome），并將提取的exosome與NK細胞進行共培養(yǎng)。使用ELISA檢測細胞上清外環(huán)境細胞因子分泌情況，同時將786-O敲減TGF-β1后提取的exosome與NK細胞共孵育，檢測NK細胞的殺傷功能，并使用WB檢測T

4、GF-β下游信號通路，分析腎透明細胞癌來源的外泌體誘導(dǎo)NK細胞功能失調(diào)的機制。
　　結(jié)果：
　　1.我們發(fā)現(xiàn)腎透明細胞癌組織中浸潤的NK細胞頻數(shù)較癌旁組織明顯較少，較非癌組織較多。而外周血中 NK細胞比例并無明顯差異。表型檢測發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤的NK細胞活化性受體表達減少，抑制性受體表達增多，呈抑制性表型。
　　2.進一步檢測NK細胞的功能，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤的NK細胞殺傷和分泌細胞因子的功能發(fā)生缺陷。比較不同腫瘤分期NK分

5、泌及殺傷功能，隨著患者腫瘤惡性程度增加，NK細胞的分泌及殺傷功能下降程度增加。
　　3.我們培養(yǎng)原代腫瘤細胞，通過transwell共培養(yǎng)體系我們發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞主要通過外泌體作用的方式抑制 NK細胞功能。提取鑒定原代細胞的外泌體與 NK細胞共孵育，發(fā)現(xiàn)外泌體可以抑制NK細胞的功能。比較不同腫瘤分期腫瘤組織分泌外泌體的情況，我們發(fā)現(xiàn)隨著患者腫瘤惡性程度增加，外泌體的分泌濃度增多。
　　4.ELISA顯示腫瘤細胞微環(huán)境大量分布T

6、GF-β1，并且我們在外泌體上檢測到TGF-β1表達。通過敲減TGF-β1，我們發(fā)現(xiàn)腎透明細胞癌來源的外泌體通過TGF-β1/SMAD信號途徑作用于NK細胞，誘導(dǎo)其功能發(fā)生缺陷。
　　結(jié)論：
　　1.腎透明細胞癌中，腎透明細胞癌組織中浸潤的NK細胞頻數(shù)較癌旁組織明顯較少，較非癌組織較多。NK細胞呈現(xiàn)抑制性的表型。
　　2.腫瘤侵潤的NK細胞分泌細胞因子及殺傷功能發(fā)生明顯缺陷，并且隨著患者腫瘤惡性程度增加，NK細胞的分泌