孕酮調(diào)節(jié)乳腺癌中乳腺癌耐藥蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、[研究背景]
　　 乳腺癌的發(fā)病率位居女性惡性腫瘤之首，而獲得性多藥耐藥(Multidrugresistance，MDR)是導(dǎo)致其化療失敗得重要因素之一，為乳腺癌的治療帶來巨大障礙。在藥物誘導(dǎo)后，腫瘤細(xì)胞對結(jié)構(gòu)和功能不相關(guān)的藥物耐藥，即為多藥耐藥現(xiàn)象。在人類耐藥腫瘤細(xì)胞中，MDR機(jī)制主要涉及三種表型的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白:P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(Multidrugresistanceprote

2、in，MRP1～7)和乳腺癌耐藥蛋白(Breastcancerresistanceprotein,BCRP/ABCG2)。這些蛋白均屬于ATP結(jié)合盒(Adenosinetriphosphate-bindingcassette,ABC)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，作為藥物排出泵，可以導(dǎo)致胞內(nèi)的細(xì)胞毒藥物濃度降低，使腫瘤細(xì)胞對多種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥。
　　 BCRP/ABCG2是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員之一，在多藥耐藥方面起著不可忽視的作用。

3、因最先在乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/AdrVp中被發(fā)現(xiàn)而得名。它可以在多種正常組織、細(xì)胞系和腫瘤組織中表達(dá)。過表達(dá)BCRP可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞系對多種化療藥物耐藥，米托蒽醌、拓?fù)涮婵?、阿霉素等均為其底物?br>　　 人的BCRP基因，由ABCG2基因編碼，定位于染色體4q22，含有16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子，基因跨度為66kb，編碼分子量為72kD的跨膜蛋白;BCRP基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游312bp的序列，是該基因啟動子的基本活性區(qū)域。B

4、CRP蛋白在結(jié)構(gòu)上相當(dāng)于P-gp的一半，又被稱為不完全轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。BCRP蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)合成，經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜而發(fā)揮作用。以往在實(shí)體腫瘤中，對BCRP表達(dá)的判定多以胞漿陽性為主，但這可能并不能反映出該蛋白的功能狀態(tài)。
　　 乳腺癌是一種激素依賴性的全身性疾病，其生長受雌激素、孕激素和雄激素等類固醇激素調(diào)節(jié)。雌激素及雌激素受體(Estrogenreceptor,ER)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中的作用已得到深入的研究和廣泛的認(rèn)同。以往

5、一直認(rèn)為孕激素受體(Progesteronereceptor，PR)僅僅是ER具有功能活性的一個(gè)標(biāo)志。但與此相悖的是，臨床上大概有5％左右的乳腺癌是ER-/PR+，并且這類ER-/PR+的腫瘤比ER+/PR+、ER+/PR-、ER-/PR-的對激素反應(yīng)性差、侵襲力強(qiáng)，預(yù)后更差。這提示我們，PR可能不僅僅是ER具有功能活性一個(gè)標(biāo)記，它或許具有某些非ER依賴性的功能。
　　 本課題組曾報(bào)道17β-雌二醇與ER結(jié)合后，可以結(jié)合至雌激素

6、反應(yīng)元件(Estrogenresponseelement，ERE)進(jìn)而增強(qiáng)BCRP的轉(zhuǎn)錄活性;而其拮抗劑三苯氧胺、托瑞米芬則可以降低BCRP的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)由BCRP介導(dǎo)的MDR。在對絨毛膜細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，BCRP啟動子5'端側(cè)翼序列上游的-243到-115bp之間的ERE同時(shí)也是一個(gè)孕激素反應(yīng)元件(progesteroneresponseelement，PRE)，但目前尚無實(shí)驗(yàn)報(bào)道，PRE是否具有調(diào)節(jié)乳腺癌中BCRP介導(dǎo)的MDR的功能

7、。
　　 本研究中，我們首先應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法，檢測了95例乳腺癌組織中BCRP、ERα、PR及人表皮生長因子受體-2(Her-2)的表達(dá);進(jìn)而，構(gòu)建含有PRE的啟動子序列，將其連接到已含有BCRPcDNA的載體上，構(gòu)建出含有PRE的BCRP啟動子和BCRPcDNA的載體pEGFP-C1/P-BCRP，同時(shí)以含有CMV啟動子和BCRPcDNA的載體pEGFP-C1/C-BCRP作對照，分別轉(zhuǎn)染PR+的細(xì)胞株T47D、MCF-

8、7和PR-細(xì)胞株MDA-MB-231，加入不同濃度的孕酮(progesterone，PROG)及其拮抗劑米非司酮（Mifepristone，MFP/RU-486），檢測BCRP在mRNA水平、蛋白水平及功能上的改變，并闡述孕激素調(diào)節(jié)乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的可能機(jī)制。
　　 [實(shí)驗(yàn)方法]
　　 1.免疫組化:
　　 采用免疫組織化學(xué)二步法（PV-9000法）檢測95例原發(fā)性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中BCRP、ERα、P

9、R和Her-2的表達(dá)情況，并分析了BCRP的表達(dá)與后三者之間的相關(guān)性，以及與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　 2.質(zhì)粒構(gòu)建:
　　 1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建:應(yīng)用ApaⅠ和BamHⅠ雙酶切pcDNA3.1/BCRPcDNA（本實(shí)驗(yàn)室保存），并將其連接至含有綠色熒光蛋白和篩選標(biāo)記的質(zhì)粒pEGFP-C1的多克隆位點(diǎn)，命名為pEGFP-C1/C-BCRP;
　　 2)人工合成含有PRE的BCRP核心啟動子區(qū)，并連接至pE

10、GFP-C1/BCRP載體中，命名為pEGFP-C1/P-BCRP，經(jīng)TaKaRa公司測序結(jié)果證實(shí)正確后，大量擴(kuò)增。
　　 3.細(xì)胞系的檢測:
　　 應(yīng)用WesternBlotting法檢測本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞系MCF-7、T47D、MDA-MB-231中PR表達(dá)。
　　 4.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:
　　 將重組質(zhì)粒pEGFP-C1/P-BCRP、pEGFP-C1/C-BCRP分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PR(+)MCF-7和P

11、R(-)的MDA-MB-231細(xì)胞系;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PR(+)的T47D細(xì)胞系。對瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組，48hrs后收集細(xì)胞沉淀;對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組，G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)BCRP的T47D/P-BCRP、T47D/C-BCRP細(xì)胞系后，收集細(xì)胞沉淀。應(yīng)用WesternBlotting檢測BCRP蛋白的表達(dá)，鑒定耐藥細(xì)胞系。
　　 5.檢測PROG對BCRP表達(dá)及功能的調(diào)節(jié)作用:
　　 各組細(xì)胞分別加入不同濃度的PROG或RU-486，根據(jù)不

12、同的實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)培養(yǎng)24hrs、48hrs或72hrs，抽提耐藥細(xì)胞總RNA、總蛋白，應(yīng)用RT-PCR或qPCR檢測BCRPmRNA水平的變化;Westernblotting檢測BCRP蛋白表達(dá)的變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測耐藥細(xì)胞對米托蒽醌外排功能的變化;MTT法檢測細(xì)胞耐藥指數(shù)的變化。
　　 6.應(yīng)用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA):
　　 觀察細(xì)胞核蛋白中的PR與BCRP啟動子區(qū)PRE之間的相互作用，以探討PR在調(diào)節(jié)BCRP介導(dǎo)的M

13、DR中的作用機(jī)制。
　　 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　 1.免疫組化:95例乳腺癌中，29例BCRP呈膜陽性(30.53％)，45例PR呈核陽性(47.37％)，65例ERα呈核陽性表達(dá)(68.42％);統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，BCRP與ERα、PR蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(P=0.017、p=0.045)、與是否有淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān);與Her-2的表達(dá)、患者的年齡、腫瘤的大小無關(guān)。
　　 2.乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、T47D均為PR

14、(+)，而MDA-MB-231為PR（-）。
　　 3.重組質(zhì)粒pEGFP-C1/P-BCRP、pEGFP-C1/C-BCRP轉(zhuǎn)染后，建立的耐藥細(xì)胞系MCF-7/P-BCRP、MCF-7/C-BCRP、T47D/P-BCRP、T47D/C-BCRP、MDA-MB-231/P-BCRP和MDA-MB-231/C-BCRP，WesternBlotting檢測表明BCRP蛋白的表達(dá)明顯增加。
　　 4.PROG處理后
　

15、　 (1)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組:
　　 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24hrs后，MCF-7/P-BCRP、MCF-7/C-BCRP、MDA-MB-231/P-BCRP和MDA-MB-231/C-BCRP各組細(xì)胞分別加入不同濃度的PROG(0、10-13、10-11、10-9、10-7、10-5M)。PROG作用24hrs后，MCF-7/P-BCRP組與對照組比較，BCRPmRNA水平分別降低了12.5％，19.8％，32.43％，42.6％和50.1％(

16、P＜0.01);而在MCF-7/C-BCRP組，各處理組間BCRPmRNA表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)。同樣，在MDA-MB-231/P-BCRP和MDA-MB-231/C-BCRP組，各處理組間BCRPmRNA表達(dá)亦無明顯差異(P＞0.05)。PROG作用48hrs后，MCF-7/P-BCRP組與對照組比較，BCRP蛋白表達(dá)水平分別降低了33.3％，50.0％,59.5％，66.7％and80.9％(P＜0.01），而MCF-7/C

17、-BCRP組，各處理組間BCRP表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)。并且，在MDA-MB-231/P-BCRP和MDA-MB-231/C-BCRP組，BCRP蛋白的表達(dá)在各組間亦無明顯差異(P＞0.05)。
　　 (2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組:
　　 建立兩種耐藥細(xì)胞系T47D/P-BCRP、T47D/C-BCRP后，各組細(xì)胞分別加入不同濃度的PROG(0、10-13、100-11、10-9、10-7、10-5M)。在T47D/P-BC

18、RP組，PROG以濃度依賴方式抑制BCRPmRNA的表達(dá);并且這種抑制作用可被10倍于PROG(10-5M)濃度的RU-486(10-4M)所拮抗(P＜0.01)。而在T47D/C-BCRP組，PROG或PROG聯(lián)合RU-486處理后，均未見BCRPmRNA有明顯變化(P＞0.05)。在T47D/P-BCRP細(xì)胞株，PROG可以濃度依賴方式抑制BCRP蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，并且這種作用可以被RU-486所拮抗;T47D/C-BCR

19、P，10-11M和10-9M組PROG刺激BCRP蛋白的表達(dá)，但這種作用不能被RU-486所阻斷。
　　 (3)米托蒽醌外排實(shí)驗(yàn)表明:PROG(10-5M)處理后，與對照組比較，T47D/P-BCRP細(xì)胞由于BCRP蛋白表達(dá)降低，熒光峰值右移，且該現(xiàn)象可以被RU-486(10-4M)所拮抗;在T47D/C-BCRP組，PROG(10-5M)處理后，熒光峰值左移，且該效應(yīng)不能被RU-486所拮抗。
　　 (4)MTT檢測各

20、組細(xì)胞對米托蒽醌的耐受性，結(jié)果顯示，T47D，T47D/P-BCRP+PROG,T47D/P-BCRP,T47D/C-BCRP+PROG和T47D/C-BCRP各組細(xì)胞組中，IC50分別為0.06±0.02μmol/L，0.26±0.03μmol/L，.36±0.36μmol/L，1.25+0.26μmol/L和1.40±0.17μmol/L。T47D/C-BCRP組與T47D組比較，其對化療藥的敏感性增加了24.40倍(P＜0.01）

21、;PROG處理后，其耐藥性增加了22.61倍(P＜0.01）。而在T47D/P-BCRP組，與T47D組比較，其細(xì)胞對化療藥的耐受性增加了25.08倍（P＜0.01）;PROG處理后，其細(xì)胞對化療藥的耐受性降低至對照組的4.63倍，差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 5.EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:細(xì)胞核蛋白與含有保守性PRE序列的寡核苷酸探針和抗PR抗體共同孵育后，在PR(+)的MCF-7細(xì)胞株可檢測到特異性結(jié)合復(fù)合物，而在PR(

22、-)的MDA-MB-231則未見到這種特異性結(jié)合。
　　 [結(jié)論]
　　 1.本實(shí)驗(yàn)結(jié)合BCRP的功能特點(diǎn)，對免疫組化結(jié)果進(jìn)行評分，結(jié)果顯示BCRP與ERα、PR的表達(dá)負(fù)相關(guān);與是否有淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān);與Her-2的表達(dá)、患者的年齡、腫瘤的大小無關(guān)。
　　 2.PROG在細(xì)胞的水平，可明顯抑制PR陽性乳腺癌細(xì)胞中BCRPmRNA和蛋白的表達(dá)，提示孕激素可能具有與雌激素受體拮抗劑相似的作用、即可逆轉(zhuǎn)BCRP介導(dǎo)