線粒體基因復(fù)合擴增進行種屬鑒定的研究.pdf

1、目的:生物性檢材的種屬鑒定是法醫(yī)物證學(xué)主要研究內(nèi)容之一。本課題針對線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)編碼序列的保守區(qū)和可變區(qū)在人與哺乳動物間的異同，設(shè)計并建立穩(wěn)定可靠的種屬鑒定體系，探索一種適合法醫(yī)學(xué)實踐的，快速、靈敏、簡便而實用的種屬鑒別方法，以解決當(dāng)前種屬鑒定中存在的不足。 方法:針對本課題的研究目的，對mtDNA 的37個基因進行研究，制定目的基因篩選原則，遵循該原則篩選出合適的編碼基因，根據(jù)

2、建立復(fù)合擴增體系的要求，建立穩(wěn)定可靠的線粒體基因復(fù)合擴增反應(yīng)體系。復(fù)合擴增產(chǎn)物用非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳(PAGE)、硝酸銀染色技術(shù)進行種屬鑒定。為驗證該系統(tǒng)的穩(wěn)定性以及在法醫(yī)學(xué)實踐中的可行性，進行了包括系統(tǒng)靈敏度檢測、不同環(huán)境下樣本的檢測、形成于不同基質(zhì)上樣本的檢測和陳舊樣本等的檢測，從而對其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值進行評估。 結(jié)果:根據(jù)mtDNA兩個編碼基因設(shè)計cyt b和ND6兩對引物進行復(fù)合擴增，PAGE-銀染顯色。結(jié)果顯示

3、為兩條電泳條帶者為人的樣本，兩條帶分別為cyt b基因片段(358bp)和ND6基因片段(181bp)；顯示為一條電泳條帶者為動物樣本，對應(yīng)為cyt b基因片段(358bp)。本方法最小檢出：DNA模板量為0.25pg，遠高于其他方法，因此尤其適合于法醫(yī)學(xué)上微量檢材的檢測。將本研究建立的cyt b/ND6復(fù)合擴增體系檢測處于不同環(huán)境下的實驗樣本。結(jié)果顯示，在4℃、室溫和37℃環(huán)境條件下，檢材經(jīng)過120天后，本方法均可正確區(qū)分人和動物樣本

4、。而將檢材置于風(fēng)干機內(nèi)、室內(nèi)和模擬的潮濕環(huán)境，結(jié)果顯示經(jīng)過90天后，對置于室內(nèi)和風(fēng)干機內(nèi)的檢材進行檢測，本方法均可正確區(qū)分人和動物樣本；而在模擬的高度潮濕環(huán)境中，放置50天的檢材的PCR產(chǎn)物電泳條帶已略微弱于放置30天的檢材，而放置90天的樣本無可見的條帶。餐巾紙、棉簽、塑料薄膜、塑料泡沫、水泥地面、白墻面、泥土、窗簾布上的血痕，本方法均獲得了正確的檢測結(jié)果。對于陳舊樣本的檢測，本方法能正確鑒別四川成都地區(qū)室溫下放置7年～9年的血痕樣本