高產(chǎn)類胡蘿卜素巴斯德畢赤酵母表達(dá)宿主菌的構(gòu)建.pdf

1、分泌型的巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是目前酶工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的高效表達(dá)宿主菌之一，其高密度發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的大量菌體利用率低，從而造成了大量的資源浪費(fèi)，因此進(jìn)一步開發(fā)具有高附加值的畢赤酵母菌體具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。類胡蘿卜素在人類健康和生活中發(fā)揮著重要作用，已廣泛應(yīng)用于食品、飼料、保健品等領(lǐng)域。本研究旨在向畢赤酵母宿主菌株GS115中導(dǎo)入類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵基因，獲得能夠在胞內(nèi)高產(chǎn)類胡蘿卜素而胞外高效分

2、泌表達(dá)異源蛋白的工程菌，最終實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)中菌體資源的高附加值利用。
　　本研究選擇了6個(gè)不同的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子PGCW14、PTEF、PPGK1、PGAP、PILV5和PAOD，及其相應(yīng)的終止子用于表達(dá)來(lái)源于紅發(fā)夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）的β-胡蘿卜素(β-Carotene)和蝦青素(Astaxanthin)合成途徑中的關(guān)鍵基因（idi、crtE、crt YB、crtI、crtS和crtR）

3、。各基因表達(dá)框之間均沒有同源序列，有效的提高了重組菌株的遺傳穩(wěn)定性。通過構(gòu)建pPICZαA-idi-crtE-crtYB-crtI和pPICZαA-idi-crtE-crtYB-crtI-crtS-crt重組載體并轉(zhuǎn)化到GS115菌株中，分別篩選得到一株能夠在細(xì)胞內(nèi)高效合成β-胡蘿卜素的重組菌GS115-CARO（培養(yǎng)72 h后其β-胡蘿卜素產(chǎn)量為28 mg/g細(xì)胞干重）和一株產(chǎn)蝦青素的菌株。
　　選取來(lái)源于嗜熱籃狀菌(Talar

4、omyces leycettanus JCM12802)的甘露聚糖酶基因man5T來(lái)驗(yàn)證外源基因在宿主菌P.pastoris GS115和P.pastoris GS115-CARO中異源表達(dá)的差異。分別將man5T基因轉(zhuǎn)化到GS115和GS115-CARO宿主菌株后，篩選出甘露聚糖酶活性最高的陽(yáng)性克隆子，其搖瓶水平上的甘露聚糖酶表達(dá)量分別為280 U/mL和286 U/mL，沒有顯著差異(P＞0.05)，但宿主菌GS115-CARO的胞

5、內(nèi)β-胡蘿卜素產(chǎn)量高達(dá)到31.27 mg/g細(xì)胞干重。結(jié)果表明工程菌株GS115-CARO作為表達(dá)宿主菌不僅可以實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高效表達(dá)，還能高產(chǎn)胡蘿卜素，有效地提升酵母菌體資源的利用價(jià)值。
　　本研究構(gòu)建的高產(chǎn)β-胡蘿卜素的巴斯德畢赤酵母工程菌GS115-CARO具有較好的遺傳穩(wěn)定性，表達(dá)外源蛋白的能力和常用宿主菌GS115相當(dāng)，可用作表達(dá)宿主菌。在高密度發(fā)酵過程中可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)合成胡蘿卜素，胞外高效表達(dá)外源蛋白，從而有效的提升