金屬標記結合選擇離子監(jiān)測質(zhì)譜技術的蛋白質(zhì)絕對定量新方法研究.pdf

1、定量蛋白質(zhì)組學是目前蛋白質(zhì)組學研究的熱點和難點之一。定量蛋白質(zhì)組學可以分為相對定量和絕對定量,其中絕對定量方法是定量蛋白質(zhì)組學發(fā)展的主要瓶頸。定量試劑盒價格昂貴,蛋白質(zhì)組學的高通量特點,內(nèi)標肽段制備困難,實際樣本酶解不完全等問題制約著蛋白質(zhì)絕對定量方法的發(fā)展。
　　本論文針對絕對定量蛋白質(zhì)組學存在的問題,首先針對傳統(tǒng)溶液酶解存在的酶解時間較長、酶自切物干擾、蛋白酶不能重復使用以及實際樣本酶解不完全等問題,制備了一種新型的原子轉(zhuǎn)移自

2、由基聚合修飾銀絲固定化酶反應器。另外還發(fā)展了金屬標記結合選擇離子監(jiān)測質(zhì)譜技術(SIM)的絕對定量新方法,并應用于騰沖嗜熱菌中蛋白質(zhì)的絕對定量分析。
　　本論文由三章組成。第一章概述了定量蛋白質(zhì)組學的研究現(xiàn)狀、化學標記結合質(zhì)譜方法在定量蛋白質(zhì)組學中的應用、金屬標記的研究現(xiàn)狀和發(fā)展前景、酶解對定量蛋白質(zhì)組學的影響等內(nèi)容,最后結合當前研究背景提出了本課題的研究內(nèi)容。
　　第二章制備了一種以銀絲為載體的新型的固定化酶反應器。采用標準

3、蛋白質(zhì)和質(zhì)譜考察了銀絲固定化酶反應器的酶解效率、重復性和回收率。結果表明:絨毛狀聚合物修飾的銀絲固定化酶反應器的酶解效率較高,酶解標準蛋白BSA20min后,肽段的氨基酸序列覆蓋率可達93％,好于傳統(tǒng)溶液酶切方法酶切16h得到的79%的覆蓋率;使用該固定化酶反應器在一個月內(nèi)8次酶解BSA所得的氨基酸序列覆蓋率在89%到97%之間,平均覆蓋率為94%,顯示出其具有良好的穩(wěn)定性。另外MYO的回收率實驗結果表明該固定化酶的回收率為87.67%

4、。最后,銀絲固定化酶反應器酶解騰沖嗜熱菌全蛋白20min所鑒定到的序列覆蓋率和鑒定的蛋白數(shù)量與同樣條件下溶液酶解16小時的結果接近,而零漏切位點肽段的比例更高,證明該固定化酶對實際樣本的酶解更加完全。
　　第三章建立了金屬標記結合選擇性離子監(jiān)測質(zhì)譜(SIM)技術的蛋白質(zhì)絕對定量新方法。實驗考察了金屬標記效率、金屬標記的穩(wěn)定性、標記后肽段的色譜保留行為、質(zhì)譜行為、線性范圍和準確度,實驗結果表明金屬標記具有標記效率高,穩(wěn)定性好,色譜保