高純度Taq DNA聚合酶制備技術(shù)研究.pdf

1、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)是分子生物學領(lǐng)域最重要的研究工具之一。在PCR技術(shù)中，DNA聚合酶起著關(guān)鍵性作用。PCR反應(yīng)擴增DNA是在高溫條件下進行的，因此需要一種熱穩(wěn)定的酶。Taq DNA聚合酶（Taq酶）是從嗜熱桿菌(Thrmus aquaticus)中分離純化得到的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，是PCR反應(yīng)中最常用的一種DNA聚合酶。
　　 Taq酶的克隆、表達和純化已經(jīng)得到廣泛研究。但是如何去除酶攜帶的DNA是純化Taq酶的一大難點

2、。購買的Taq酶在使用中也常發(fā)現(xiàn)酶中有DNA污染，在某些PCR反應(yīng)中如16S rDNA的擴增中，Taq酶攜帶的微量DNA也會作為模板擴增從而干擾實驗結(jié)果的判斷。為解決這一問題，本論文采用PEG-Na2SO4法、聚乙烯亞胺(PEI)沉淀法、鎳-NTA珠純化和Salecan-Na2SO4法去除外源DNA。Salecan（索拉膠）是由土壤農(nóng)桿菌(Agrobacterium sp.ZX09)分泌的胞外多糖，它是一種新的水溶性β-葡聚糖。實驗證實

3、，由Salecan與Na2SO4組成的兩相體系中，Taq酶與DNA可完全分布在兩個不同的相中，同時一部分雜蛋白也分布在含DNA的相中，因此確定為純化Taq酶的最優(yōu)方法。
　　 由退火溫度、引物濃度或Taq酶在PCR起始時的反應(yīng)活性等因素引起的PCR反應(yīng)中非特異性條帶和引物二聚體的產(chǎn)生，這一問題在PCR反應(yīng)中普遍存在。熱啟動PCR是提高PCR特異性的最重要方法之一。本文中使用制備的Taq酶抗體，低溫下抑制酶的活性，PCR反應(yīng)進入高

4、溫階段時Taq酶的活性被釋放，減少非特異性條帶和引物二聚體的形成，即熱啟動。
　　 很多實驗證明β-葡聚糖具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，可以作為佐劑和免疫增強劑增加巨噬細胞或自然殺傷細胞的活性。目前已發(fā)現(xiàn)Salecan具有穩(wěn)定餐后血糖、緩解甚至削弱急性肝損傷、降低肝脂、血脂、體脂、體重和膽固醇等生理指標等功能。因此，我們提出假想，Salecan與某些β-葡聚糖一樣也具有免疫調(diào)節(jié)作用等生物學活性，能提高抗體效價，并進行驗證。研究證實，S