HBV DNA聚合酶及SARS-CoV S蛋白的表達(dá)研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)屬于嗜肝性病毒(hepadnavirus)家族,它的基因組是約為3.2kb的部分雙鏈的環(huán)狀DNA,包含四個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF),分別編碼表面蛋白(S)、核心蛋白(C)、多聚酶(P)、X四類(lèi)蛋白.多聚酶P蛋白分子量約為90kDa,包含有末端蛋白(terminal protein、TP),間隔區(qū)(Spacer),逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA聚合酶(Reverse Transcriptase/DNA Polymerase,RT)及核

2、糖核酸酶H(RNaseH)四個(gè)結(jié)構(gòu)域.由于HBV DNA聚合酶在結(jié)構(gòu)上可能有別于一般已知的逆轉(zhuǎn)錄酶,有獨(dú)特的功能結(jié)構(gòu)特征,因此,表達(dá)HBV DNA聚合酶及各個(gè)區(qū)段,對(duì)它們的結(jié)構(gòu)和功能活性進(jìn)行研究,將為研制新型特異的抗病毒藥物奠定基礎(chǔ).本論文以含有HBV adr1亞型全基因組cDNA的質(zhì)粒pBS_HBV3.6II為摸板擴(kuò)增出所需的各片段,然后將構(gòu)建N端帶有Flag標(biāo)記,C端帶有包裝信號(hào)ε的聚合酶全長(zhǎng)基因克隆到pFastBacI中并利用Ba

3、c-to-Bac昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá),用以研究藥物突變對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制和耐藥性的影響.同時(shí)分別利用不同的表達(dá)載體對(duì)TP和RT區(qū)段在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)研究.著重對(duì)重組質(zhì)粒p6Hi s-TP在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá),6His-TP主要以包涵體的形式存在于菌體中.經(jīng)破菌、離心洗滌,變性后再用Ni-NTA柱純化,可以得到高純度的目的蛋白,并摸索了復(fù)性條件.本論文還對(duì)SARS病毒(SARS-CoV)的表面刺突蛋白(Spike pr

4、otein)進(jìn)行了表達(dá)研究.S蛋白是SARS病毒顆粒表面的糖蛋白,作為病毒入侵宿主細(xì)胞的媒介,能夠結(jié)合宿主細(xì)胞表面的病毒受體.因此,S蛋白是研制SARS疫苗的主要靶蛋白.成功表達(dá)SARS-CoV關(guān)鍵蛋白,對(duì)SARS病毒蛋白結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行研究,是闡明SARS感染人體的機(jī)理、建立分子水平的篩選模型以及開(kāi)展抗SARS藥物篩選的必由途徑.此研究?jī)?nèi)容以本實(shí)驗(yàn)室RT-PCR獲得的全長(zhǎng)S基因(3765bp,BJ01)為模板擴(kuò)增獲得6段長(zhǎng)短各異的片段,