鹽酸戊乙奎醚預(yù)先給藥對(duì)新生大鼠內(nèi)毒素性腎臟損傷的影響.pdf

1、新生兒急性腎損傷是NICU的常見(jiàn)疾病之一。雖然關(guān)于新生兒腎損傷的研究還相對(duì)較少，但是新生兒急性腎損傷卻很常見(jiàn)。且由急性腎損傷造成的死亡也很常見(jiàn)，晚期極易造成腎功能不全，在極低體重新生兒以及合并其它疾病者更甚。近年來(lái)，對(duì)新生兒急性腎損傷的研究日漸增多。新生兒的血流動(dòng)力學(xué)最突出的特點(diǎn)是血容量低下，腎臟的灌注量也低。因此，在休克、感染、低體溫等各種病理狀態(tài)下，新生兒的腎功能更易遭到損害，引起新生兒腎損傷。由內(nèi)毒素所致的急性腎功能衰竭的死亡率約

2、占70％。目前，關(guān)于內(nèi)毒素性急性腎功能衰竭的病理機(jī)制還不明確。脂多糖（LPS）作為內(nèi)毒素，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物內(nèi)毒素性臟器損傷模型的制備過(guò)程中。內(nèi)毒素性腎損傷時(shí)腎臟的血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，微循環(huán)障礙，使機(jī)體呈現(xiàn)缺血缺氧狀態(tài)；且內(nèi)毒素性腎損傷時(shí)，腎臟谷氨酰胺的耗竭加速，腎小管上皮細(xì)胞的氧化代謝也發(fā)生障礙。有研究表明缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α，作為低氧時(shí)發(fā)揮作用的調(diào)控基因，可在缺氧條件下產(chǎn)生核蛋白，與其靶基因結(jié)合，使機(jī)體對(duì)缺氧環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性改變，且內(nèi)

3、毒素性腎損傷時(shí)HIF-1α過(guò)表達(dá)。HIF-1α可通過(guò)NF-κB途徑促發(fā)炎性因子的釋放，加重腎臟的損害；另有研究表明，谷氨酰胺Gln作為腎臟糖異生的底物，以及腎小管細(xì)胞氧化代謝的燃料，在內(nèi)毒素血癥發(fā)生時(shí)可以抑制腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，且可以減緩線粒體呼吸功能受抑制程度。鹽酸戊乙奎醚（PHC）是一種廣泛應(yīng)用于臨床麻醉中的新型抗膽堿藥。很多研究表明，其在改善休克患者的微循環(huán)、減輕內(nèi)臟多器官的損傷方面發(fā)揮著重要作用，可視為糾正內(nèi)毒素性休克時(shí)微循環(huán)

4、痙攣理想的血管活性藥物。且在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，鹽酸戊乙奎醚可通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α和Gln的表達(dá)來(lái)降低內(nèi)毒素性腸損傷，且我們通過(guò)大量的臨床案例觀察到鹽酸戊乙奎醚的應(yīng)用可以明顯改善內(nèi)毒素性急性腎損傷時(shí)腎臟的功能。因此，本研究制備的模型為L(zhǎng)PS致新生7日齡大鼠急性內(nèi)毒素性腎損傷，探討預(yù)先使用抗膽堿藥鹽酸戊乙奎醚對(duì)腎組織HIF-1α和Gln表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其具體作用機(jī)制。
　　目的
　　觀察新生大鼠內(nèi)毒素性急性腎損傷時(shí)腎組織中

5、HIF-1α以及Gln的表達(dá)；以鹽酸戊乙奎醚預(yù)先給藥為干預(yù)手段，觀察其對(duì)新生大鼠內(nèi)毒素性腎損傷時(shí)HIF-1α以及Gln的表達(dá)的影響；探討鹽酸戊乙奎醚預(yù)先給藥對(duì)內(nèi)毒素性腎損傷時(shí)實(shí)現(xiàn)腎臟保護(hù)作用的具體機(jī)制，以期找到新的治療途徑來(lái)面對(duì)新生兒內(nèi)毒素性腎損傷。
　　材料與方法
　　1實(shí)驗(yàn)對(duì)象
　　SD大鼠72只（1周齡，SPF級(jí)，健康）；購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（鄭州大學(xué)），不限雌雄，體重15.0~18.0g。
　　2實(shí)驗(yàn)方

6、法
　　2.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象分組
　　依據(jù)研究?jī)?nèi)容，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為兩部分:48只和24只。第一部分：取48只，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將其分為3組，每組16只（n=16）。分別為C組：對(duì)照組（PBS液）；K組：LPS腎損傷組和P組：PHC組。此部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于造模后觀察其行為學(xué)方面及精神狀態(tài)的變化，并計(jì)算各組造模后24h時(shí)的死亡率。第二部分：隨機(jī)將剩余的24只新生鼠分為C組、K組和P組，每組8只。此部分實(shí)驗(yàn)用于觀察三組間腎組織HIF-1

7、α和Gln以及相關(guān)因子的表達(dá)、腎組織濕/干重比的測(cè)定以及光鏡下觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)改變。
　　2.2動(dòng)物模型的制備
　　兩部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同時(shí)制模。
　　C組：腹腔注射PBS液10ml/kg；
　　P組：腹腔PHC2mg/kg注射，將濃度稀釋至0.10mg/ml；
　　K組：腹腔LPS5mg/kg注射，將濃度稀釋至1.0mg/ml。
　　給藥方式：P組和K組均注射LPS，P組LPS注射前30min注射PH

8、C。腹腔注射部位要求一致，回抽無(wú)血無(wú)氣體。
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于制模后標(biāo)記清楚，放回鼠籠與母鼠共同喂養(yǎng)，保持喂養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定。第二部分老鼠于造模后6小時(shí)時(shí)麻醉，取材，凍存，備用。
　　2.3腎組織的標(biāo)本采集
　　腹腔注射3ml/kg的10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，麻醉后接小動(dòng)物呼吸機(jī)，將老鼠以背臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。從胸部正中剪開(kāi)2.0~2.5cm，暴露肋骨和肌肉，觸摸到心尖的搏動(dòng)后，使用注射器（5號(hào)針頭）進(jìn)行心臟采血。將血標(biāo)本于室溫

9、下（22℃~25℃）靜置1小時(shí)，1200r/min離心10分鐘，取上清液，-80℃冰箱中保存待檢。開(kāi)腹后取下左右兩腎。右腎上二分之一，勻漿處理，用于HIF-1α、Gln等指標(biāo)的檢測(cè)；右腎下二分之一，使用Trizol法提取RNA，RT-PCR法檢測(cè)HIF-1αmRNA的表達(dá)；左腎上二分之一用于腎濕/干重比的檢測(cè)；左腎下二分之一，HE染色后，觀察其病理學(xué)改變。
　　2.4檢測(cè)指標(biāo)
　　2.4.1計(jì)算腎組織濕/干重比（W/D）

10、r>　　使用濾紙吸取多余水分后，電子天平稱量左腎上二分之一，并記錄濕重。繼而放入70℃恒溫烘干箱48小時(shí)，行稱量，記錄干重，計(jì)算濕/干重比。
　　2.4.2腎組織形態(tài)學(xué)觀察
　　將左腎下二分之一組織放入10%多聚甲醛（多聚甲醛體積大于腎組織體積的3倍）中48小時(shí)使其固定充分。石蠟包埋，HE染色。400倍光鏡下觀察腎的組織結(jié)構(gòu)病理學(xué)改變。
　　2.4.3 ELISA法測(cè)定腎組織中TNF-α、IL-6、HIF-1α、Gln

11、的含量
　　對(duì)右腎上二分之一腎組織進(jìn)行稱重，取緩沖液PBS，以1/9容量比配置，使用勻漿器制備組織勻漿。3500r/min離心10分鐘，取上清，于-80℃冰箱中保存待使用。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒（R&D公司，美國(guó)）的使用說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TNF-α、IL-6、HIF-1α、Gln的表達(dá)。
　　2.4.4 RT-PCR法測(cè)定腎組織HIF-1αmRNA的表達(dá)
　　將右腎下二分之一組織經(jīng)DEPC水沖洗后濾紙吸干，于液氮中速凍后，隨

12、后置入-80℃冰箱保存待檢。使用Trizol法提取腎臟的RNA，HIF-1αmRNA在新生鼠腎組織的表達(dá)經(jīng)步驟：反轉(zhuǎn)錄、DNA擴(kuò)增、糖瓊脂糖凝膠電泳等檢測(cè)。
　　3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x± s)表示計(jì)量資料，多組間比較單因素方差分析，兩兩之間相比較采用最小顯著差異法（LSD-t），設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，即P值當(dāng)小于檢驗(yàn)水準(zhǔn)時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

13、　結(jié)果
　　1.生存狀態(tài)觀察腹腔注射LPS后，1小時(shí)后K組新生鼠開(kāi)始顫抖，呼吸頻率增快。于3小時(shí)后全身顏色呈現(xiàn)灰白色，活動(dòng)遲緩，體溫明顯降低。6小時(shí)后皮膚顏色較3小時(shí)時(shí)更甚，不活動(dòng)也不進(jìn)食，口唇青紫，呈現(xiàn)嚴(yán)重缺氧狀態(tài)。同時(shí)期P組新生鼠癥狀較K組狀態(tài)有明顯改善。C組新生鼠活動(dòng)、進(jìn)食及精神狀態(tài)等情況皆正常。C組、P組及K組的24h死亡率分別為0%、12.4%和50%。
　　2.腎組織的濕/干重比的結(jié)果：P組和K組較之于C組均有明

14、顯升高（P<0.05）；P組較之于K組，顯著降低（P<0.05）；各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.腎組織病理學(xué)結(jié)果顯示：C組腎組織形態(tài)學(xué)無(wú)明顯改變，基本正常。K組腎小管上皮細(xì)胞明顯腫脹，管腔變窄，充血，水腫，部分腎小管上皮細(xì)胞空泡化變形或者透明樣變性。管腔內(nèi)可見(jiàn)大量的脫落細(xì)胞、紅細(xì)胞和細(xì)胞管型，間質(zhì)血管擴(kuò)張充血，且大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與K組比較，P組腎小管上皮細(xì)胞腫脹明顯減輕，間質(zhì)少許充血以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，病理改變有明顯改善

15、。
　　4. P組和K組腎組織中的HIF-1α、IL-6、TNF-α含量較之于C組均有顯著增加（P<0.05），Gln含量顯著降低（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；較之于K組，P組腎組織中IL-6、TNF-α、HIF-1α含量均較低，Gln的含量較高（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5. HIF-1αmRNA在腎組織中的表達(dá)結(jié)果：K組和P組較之于C組，均明顯增加（P<0.05）；P組較之于與K組，明顯降低（P<0.