DLL4在胃癌中的表達(dá)及與中醫(yī)證相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　Delta-like ligand4(DLL4)是腫瘤血管發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)腫瘤血管形成，提供腫瘤生成所需要的氧和營(yíng)養(yǎng)成份，并增加血管和淋巴管通透性而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)檢測(cè)胃癌(Gastric cancer, GC)組織中DLL4蛋白的表達(dá)情況探討DLL4的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，比較胃癌不同中醫(yī)(Traditional Chine

2、se Medicine，TCM)證型患者的DLL4蛋白表達(dá)水平。以及驗(yàn)證DLL4與VEGF在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，檢測(cè)干擾DLL4的表達(dá)對(duì)VEGF表達(dá)的影響，并初步探討DLL4對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和遷移能力的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　1、收集44例胃腸外科手術(shù)切除的胃癌組織及距病灶約5cm的癌旁正常胃粘膜組織制作組織切片，采用免疫組化檢測(cè)胃癌組織及癌旁組織DLL4蛋白的表達(dá)，并分析DLL4蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的之間的關(guān)系

3、。對(duì)切除胃癌組織的患者進(jìn)行中醫(yī)辨證分型，分析胃癌證型與分期的相關(guān)性以及比較胃癌不同中醫(yī)證型患者的DLL4蛋白表達(dá)水平。
　　2、提取胃癌AGS、SGC-7901細(xì)胞株和正常胃黏膜GES-1細(xì)胞株的總RNA，用RT-PCR驗(yàn)證細(xì)胞中DLL4、VEGFmRNA的表達(dá)。
　　3、構(gòu)建4種靶向DLL4基因的干擾RNAi質(zhì)粒及1種對(duì)照質(zhì)粒，用FuGENE(@) HD介導(dǎo)轉(zhuǎn)染胃癌AGS細(xì)胞，嘌呤霉素（濃度為0.2μg/mL）篩選建立穩(wěn)定

4、細(xì)胞株。
　　4、提取DLL4-RNAi的干擾組和CON077對(duì)照組胃癌細(xì)胞株總RNA，RT-PCR檢測(cè)DLL4、VEGF的mRNA表達(dá)情況。
　　5、選取轉(zhuǎn)染后對(duì)DLL4、VEGF表達(dá)有明顯干擾作用的胃癌AGS細(xì)胞株DLL4-RNAi(34251)和DLL4-RNAi(34253)組為實(shí)驗(yàn)組，以未轉(zhuǎn)染的胃癌AGS細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組，MTT檢測(cè)DLL4被干擾后胃癌AGS細(xì)胞的增殖情況。
　　6、選取對(duì)DLL4表達(dá)有明顯干擾

5、作用的胃癌AGS細(xì)胞株DLL4-RNAi(34253)組為實(shí)驗(yàn)組，未轉(zhuǎn)染過(guò)的胃癌AGS細(xì)胞為對(duì)照組，劃痕實(shí)驗(yàn)觀察干擾DLL4表達(dá)后胃癌AGS細(xì)胞的遷移情況。
　　結(jié)果：
　　1、在44例胃癌組織標(biāo)本中，DLL4蛋白染色呈棕黃色陽(yáng)性顆粒，主要分布于腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。胃癌組織DLL4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率平均為70.5％，正常胃癌粘膜組織未見(jiàn)棕黃色顆粒。DLL4蛋白在胃癌中的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度顯著相關(guān)(p＜0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)

6、(p＜0.05)和臨床分期顯著有關(guān)(p＜0.01)，而與患者的性別、年齡、腫瘤位置等因素?zé)o關(guān)(p＞0.05)。
　　2、6種中醫(yī)證型在胃癌分期中的分布不同，x2=11.071，p＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同中醫(yī)證型胃癌組織中DLL4的陽(yáng)性表達(dá)不同，x2=12.774，p＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。胃癌6種中醫(yī)證型DLL4陽(yáng)性表達(dá)率由高到低依次為氣滯血瘀證、脾胃虛寒證、胃熱傷陰證、氣血虧虛證、痰濕凝結(jié)證、肝氣犯胃證。

7、r>　　3、RT-PCR結(jié)果顯示DLL4、VEGF mRNA在胃癌AGS、SGC-7901細(xì)胞株的表達(dá)均高于正常胃黏膜GES-1細(xì)胞。
　　4、RT-PCR結(jié)果顯示，構(gòu)建的4個(gè)DLL4-RNAi序列其中有3個(gè)質(zhì)粒能抑制DLL4的表達(dá)，其中DLL4-RNAi(34253)、DLL4-RNAi(34251)抑制DLL4 mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05); DLL4-RNAi(34251)抑制VEGF mRNA

8、表達(dá)與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，DLL4-RNAi(34253)能有效抑制VEGF mRNA表達(dá)。且VEGF mRNA表達(dá)量與DLL4表達(dá)量之間存在正相關(guān)關(guān)系。
　　5、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染DLL4-RNAi(34253)和DLL4-RNAi(34251)的AGS細(xì)胞與對(duì)照組的細(xì)胞相比增殖速率減慢，其中轉(zhuǎn)染DLL4-RNAi(34253)的胃癌細(xì)胞增殖與對(duì)照組比差異極顯著(p＜0.01）。
　　6、劃

9、痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染DLL4-RNAi(34253)的AGS細(xì)胞的遷移率比對(duì)照組明顯降低(p＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　胃癌組織中高表達(dá)DLL4蛋白，DLL4蛋白的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)，與患者的性別、年齡、腫瘤位置無(wú)關(guān)。中醫(yī)證型與胃癌TNM分期之間存在相關(guān)性，脾胃虛寒證、肝氣犯胃證多見(jiàn)于早期胃癌。胃癌不同中醫(yī)證型之間，DLL4陽(yáng)性表達(dá)存在差異。成功構(gòu)建了干擾DLL4表達(dá)的質(zhì)粒，建立了穩(wěn)定抑制DL