菊酯農(nóng)藥降解酶基因的表達、純化以及生物信息學分析.pdf

1、擬除蟲菊酯類殺蟲劑在家庭衛(wèi)生和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用已有四十多年的歷史，其廣泛應用所產(chǎn)生的大量積累和殘留，造成環(huán)境污染，妨礙生物生長，并直接或間接地危害著人體健康。發(fā)展一種有效方法消除或降低食品和環(huán)境中的菊酯農(nóng)藥殘留已成為當前迫切需要解決的問題，采用微生物農(nóng)藥降解酶解決農(nóng)藥殘留污染問題已成為當前環(huán)境科學研究的熱點，而且也是一個較新的研究領域。 酯酶(Esterase，EC3.1.1.1)屬于水解酶類，是能夠催化水解羧酸酯的所有酶的總

2、稱，具有菊酯農(nóng)藥降解活性的酯酶在自然界中廣泛存在。在過去的研究工作中，本實驗室獲得了一株能以菊酯為唯一碳源和氮源生長的伯雷克氏菌株Klebsiellasp.ZD112，通過構建基因文庫的方式，獲得了新的菊酯農(nóng)藥降解酶基因(pyrethroid-hydrolyzingesterase，estP)。這是有關微生物來源的菊酯農(nóng)藥降解酶基因的第一次報道，對estP進行基因改造以及表達研究，獲得可用于生物修復的高效菊酯農(nóng)藥降解酶工程菌，具有重要的

3、社會意義和經(jīng)濟意義。 EstP由638個氨基酸所編碼，預測分子量為73.4kDa，pI值為8.34。EstP與其它蛋白相似性極低，不屬于任何已知的蛋白超家族。本文通過對EstP的生物信息學分析，證實其屬于水解酶類。分析還發(fā)現(xiàn)，EstP與羧肽酶Taq(M32)的保守域具有一定相似性，由多序列比對分析推測Lys137，Glu116，Glu148是EstP的必需氨基酸。此外，本文還對EstP的二級結(jié)構和三級結(jié)構進行了預測。

4、 本文以Klebsiellasp.ZD112的總基因組DNA為模板，PCR擴增出estP基因，構建表達質(zhì)粒pET32a-EstP，熱激轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，28℃條件下，用終濃度為0.4mM的IPTG誘導表達。SDS-PAGE電泳分析表明，有分子量約為74kDa的目的蛋白大量表達，表達的蛋白多為包涵體，小部分具可溶性。酶活力測定證明，可溶蛋白具酯酶活性，對氯氰菊酯有較強的降解能力。使用Ni2+鰲合劑對包涵體蛋白進行

5、純化，發(fā)現(xiàn)當咪唑濃度達到300mM時，即可將目的蛋白置換下來。 為了克服原核融合表達生成的活性蛋白含量低的缺陷，實現(xiàn)菊酯農(nóng)藥降解酶的高效分泌表達，本文將克隆的酶基因連接在酵母分泌表達載體pPICZαA上，構建重組質(zhì)粒pPICZαA-EstP，用電轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒pPICZαA-EstP整合在畢赤酵母PichiapastorisX33的染色體上，篩選高拷貝克隆進行甲醇誘導表達。然而，未能觀察到目的蛋白的生成。 總之