基于α-葡萄糖苷酶三維結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)及其突變體在大腸桿菌中的高效表達(dá).pdf

1、目的：使用PCR技術(shù)獲得α-葡萄糖苷酶基因序列，通過SWISS-MODEL服務(wù)器對(duì)α-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)合氨基酸的性質(zhì)特點(diǎn)，對(duì)酶蛋白進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，采用PCR突變?cè)噭┖袑?duì)其進(jìn)行定點(diǎn)突變，并在大腸桿菌中表達(dá)，測定了重組菌、突變菌的酶活力，為進(jìn)一步研究α-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。 方法：根據(jù)GenBank中登錄的α-葡萄糖苷酶的核酸序列設(shè)計(jì)PCR引物，并在上游引物的5'端加上EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，在下游引物的5'端

2、加上HindⅢ酶切位點(diǎn)。從嗜熱脂肪芽孢桿菌U2中提取基因組DNA，應(yīng)用PCR擴(kuò)增出α-葡萄糖苷酶的核酸序列與pUC18經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白篩選，挑出陽性菌落，抽提重組質(zhì)粒鑒定后測序，測序正確后將陽性重組質(zhì)粒和表達(dá)載體pGEMEX-1經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21pLysS，經(jīng)篩選后挑取菌落，抽提重組質(zhì)粒鑒定后測序，軟件模擬α-葡萄糖苷酶蛋白結(jié)構(gòu)，尋找合適的突變位點(diǎn)，

3、設(shè)計(jì)突變引物，用突變?cè)噭┖袑?duì)α-葡萄糖苷酶蛋白序列的203、258位進(jìn)行突變，表達(dá)突變體。將克隆重組菌株、表達(dá)重組菌株和突變重組菌株的酶活力進(jìn)行測定比較。同時(shí)將陽性菌落用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)，全菌體蛋白SDS-PAGE電泳觀察表達(dá)結(jié)果。 結(jié)果：1.經(jīng)PCR技術(shù)自嗜熱脂肪芽孢桿菌U2基因組DNA中克隆了編碼α-葡萄糖苷酶的基因，測序結(jié)果與Genbank上登錄的相應(yīng)基因一致。 2.使用瑞士日內(nèi)瓦生物醫(yī)學(xué)研究所的SWISS-

4、MODEL服務(wù)器預(yù)測了α-葡萄糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)，并使用SWISSPDBViewer構(gòu)建突變體模型，使用評(píng)估軟件對(duì)模型結(jié)構(gòu)分析，達(dá)到合理化結(jié)果。 3.本研究使用TaKaRaMutanBESTKit將258位與203位氨基酸定點(diǎn)突變，達(dá)到預(yù)期突變結(jié)果。 4.構(gòu)建的表達(dá)體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21pLysS，抽提重組質(zhì)粒鑒定，測序結(jié)果表明連接方向正確，可以進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 5.經(jīng)過酶活力檢測，在表達(dá)重組體比出發(fā)菌株產(chǎn)酶活力提