人外周血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的探討.pdf

1、本研究包含以下幾部分： 第一部分大鼠視網(wǎng)膜前體細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)情況的觀察 目的：分離培養(yǎng)新生兩天的SD乳大鼠視網(wǎng)膜組織，觀察其生長(zhǎng)情況和分化潛能，為外周血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)分化探討奠定基礎(chǔ)。 方法：選取新生兩天的SD乳大鼠5只共10只眼，分離視網(wǎng)膜組織并用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)7d。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并照相記錄其形態(tài)變化。 結(jié)論：體外培養(yǎng)的新生兩天SD乳大鼠視網(wǎng)膜組織具備良好的生長(zhǎng)能力和多向

2、分化潛能。 第二部分成人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離和體外轉(zhuǎn)分化的探討 目的：探討成人外周血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的可能性。 方法：用人淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞。用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液（Ⅰ組）和視網(wǎng)膜條件誘導(dǎo)液（Ⅱ組）進(jìn)行體外連續(xù)培養(yǎng)5d；用倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡及免疫熒光技術(shù)觀察細(xì)胞的形態(tài)，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其表面標(biāo)志的變化，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)論：人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)一定條件的培養(yǎng)，在體外可被誘

3、導(dǎo)而轉(zhuǎn)分化，表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞的一些特異性標(biāo)記。 第三部分急性高眼壓對(duì)裸小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的影響 目的：觀察玻璃體腔注射制作的急性高眼壓對(duì)裸小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的影響。建立一種簡(jiǎn)單的制作裸小鼠視神經(jīng)損傷模型的方法，為人外周血單個(gè)核細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)分化和修復(fù)損傷的研究奠定基礎(chǔ)。 方法：對(duì)裸小鼠進(jìn)行單眼玻璃體腔注射，每眼10ul生理鹽水。于注射后第1d、3d、5d、7d、14d、30d和60d處死動(dòng)物，取眼球進(jìn)

4、行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并照相。對(duì)比不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)論：玻璃體腔注射一定量的生理鹽水所致的急性高眼壓能夠損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。 第四部分誘導(dǎo)培養(yǎng)后成人外周血單個(gè)核細(xì)胞裸小鼠體內(nèi)遷移情況的觀察 目的：初步觀察經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)5d的人外周血單個(gè)核細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞缺陷動(dòng)物（裸小鼠）體內(nèi)遷移和與視網(wǎng)膜整合的情況。 方法：玻璃體腔注射組：裸小鼠行單眼玻璃體腔注射5ul細(xì)胞濃度為5×10

5、6/ml Dil標(biāo)記的經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞懸液；腹腔注射組：裸小鼠行單眼玻璃體腔注射10ul生理鹽水制作急性高眼壓模型，同時(shí)腹腔注射Dil標(biāo)記的經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞，每只鼠約為1×106個(gè)細(xì)胞。兩組裸小鼠都在注射細(xì)胞后30d進(jìn)行處死，取注射眼和主要臟器進(jìn)行冰凍切片、普通病理切片、HE染色和Hotchest染片，普通光學(xué)顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞在體內(nèi)和眼內(nèi)移行和整合的情況。 結(jié)果：HE染色發(fā)現(xiàn)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜前