以人胰葡萄糖激酶為靶的降糖活性因子篩選平臺的建立.pdf

1、人胰葡萄糖激酶(PGK)具有調節(jié)肝臟中葡萄糖代謝和刺激胰腺B細胞分泌胰島素的雙重作用，是治療II型糖尿病(DM)研究的一個重要新型靶點。基于該靶點篩選得到的葡萄糖激酶激動劑(GKAs)可能對DM治療具有應用前景，已成為藥學領域的研究熱點。近幾年，國內外研究人員采用的體外篩選平臺往往使用動物來源的GK，主要建立在葡萄糖激酶(GK)的酶活測定體系上，且沒有對反應體系和反應條件進行優(yōu)化。因此，該體系篩選得到的GKAs假陽性率高，往往浪費大量的

2、人力和物力。綜上所述，建立可靠、靈敏的體外篩選平臺對新型降糖藥物的研發(fā)具有重要意義。 本論文在大腸桿菌(E.coli)中成功表達人PGK，并對其進行純化，然后用該酶建立高通量的體外降糖活性因子篩選平臺。主要研究內容如下： 1.通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增人胰葡萄糖激酶基因；以質粒6HisT-pRSET為表達載體，構建重組質粒6HisT-pRSET-PGK，轉化E.coliBL21；以IPTG誘導表達目的蛋白，通過

3、SDS-PAGE鑒定重組蛋白在E.coliBL21中的表達及其表達形式； 2.采用Ni-NTAHis.BindResin層析純化帶有6His·Tag的重組蛋白PGK；純化后的重組蛋白樣品經SDS-PAGE和QuantityOne凝膠圖象處理軟件分析表明其純度為100％；采用Bradford蛋白測定法得出純化后重組蛋白的濃度約2.07mg/mL； 3.采用雙酶偶聯(lián)酶活測定法，通過紫外可見分光光度計測定產物B-NADPH

4、的生成量，測定純化得到的重組蛋白PGK活性，發(fā)現(xiàn)PGK的比活力約3.77U/mg； 4.采用響應面分析法(RSM)，以人PGK為降糖活性因子作用靶點，GKARO-28-1675對PGK的激活率為響應值，對篩選體系和反應條件進行優(yōu)化，得到該篩選平臺的最優(yōu)條件如下： 4.1反應體系：總體積為150μL，含終濃度分別為60mMTris，2.11mMMgCl2，4.0mMATP，6.0mMB-D(+)Glucose，1.0m