微針所致皮膚創(chuàng)傷愈合對透明質(zhì)酸透皮能力的影響.pdf

1、目的：
　　目前微針經(jīng)皮給藥技術(shù)的研究集中于促滲作用，忽略了該方法所致創(chuàng)傷的愈合過程。本研究旨在探討微針所致皮膚創(chuàng)傷的愈合過程，同時研究其愈合過程對透明質(zhì)酸經(jīng)皮滲透能力的影響。
　　方法：
　　1、剃除SD大鼠背部毛發(fā)，觀察皮膚出血情況；切取剃毛后全層皮膚修剪皮下組織，觀察修剪前后皮膚層次；取全層皮膚、修剪皮下組織前后皮膚和微針針刺后皮膚行HE染色，組織學觀察角質(zhì)層完整性、修剪層次和針刺深度。
　　2、用正交設計

2、軟件專業(yè)版V3.1設計實驗，以針頭型號G、透明質(zhì)酸分子量Mr、透皮時間T作為考察因素，每個因素4個水平，即針頭型號（無針頭、25G、22G、18G）、透明質(zhì)酸分子量（10kDa、100kDa、1000kDa、1500kDa）、透皮時間（1h、3h、5h、7h）。依據(jù)正交表L16(45)，獲得16組實驗組合。
　　3、使用改良的Franz擴散池進行大鼠離體皮膚滲透實驗。用大鼠透明質(zhì)酸酶聯(lián)免疫試劑盒（Rat HA ELISA KIT）

3、測定每組實驗樣品液內(nèi)的透明質(zhì)酸濃度，以每組實驗樣品液的濃度減去相同透皮時間的空白對照組濃度作為考察指標，篩選和優(yōu)化最佳實驗組合“G-Mr-T”。
　　4、取3只已備皮的大鼠麻醉后，于脊柱兩側(cè)對稱部位畫直徑約1.5cm的圓圈，左右各三個，圓圈內(nèi)分別使用22G微針陣列和18G微針陣列穿刺，照相、肉眼觀察并記錄皮膚反應及愈合情況。
　　5、體內(nèi)實驗分組：18只已備皮的SD大鼠，體重約180g，創(chuàng)傷愈合組織學觀察、鈣黃綠素染色和HA

4、經(jīng)皮滲透分別隨機抽取2只、6只和10只，腹腔注射水合氯醛（0.003mL·g-1）麻醉。按操作4進行標記，每2只大鼠的時間點設計如下：1只大鼠的左側(cè)圓圈由頭側(cè)向尾側(cè)分別設為0h、3h、6h，右側(cè)為9h、12h、15h，另1只的左側(cè)為18h、21h、24h，右側(cè)為正常對照、空白對照；微針針刺后，無菌紗布覆蓋，待其自然愈合，到每個時間點后，取開紗布，分別進行下列實驗操作。
　　6、鈣黃綠素染色：用鈣黃綠素棉球覆蓋，避光染色10min，

5、取開棉球，用鹽水和酒精棉球交替擦拭各2遍，取全層皮膚稍微修剪皮下組織后置于載玻片， 立即在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長490nm，發(fā)射波長515nm，統(tǒng)計光斑數(shù)，獲取熒光圖像。
　　7、創(chuàng)傷愈合組織學觀察：切取全層皮膚行HE染色，觀察組織學變化。
　　8、透明質(zhì)酸體內(nèi)經(jīng)皮滲透：涂抹透明質(zhì)酸4h，用PBS液濕棉簽擦去表面滯留的HA，取下全層皮膚，清洗后將全層皮膚和皮下肉膜層分開，分別勻漿，采用Rat HA ELISA

6、KIT測定透明質(zhì)酸濃度。
　　9、正交設計軟件V3.1進行正交實驗設計的數(shù)據(jù)分析。皮膚和肉膜中HA含量用x±s表示。采用統(tǒng)計學軟件SPSS19.0進行統(tǒng)計學分析。多個實驗組樣本均數(shù)兩兩之間的比較用SNK-q檢驗（n=5），P<0.05為差異有顯著性。多個樣本率的比較用卡方分割法，為保證檢驗假設中I型錯誤a的概率不變（a=0.05），須重新規(guī)定檢驗水準a′（a′=a/2（k-1），其中a=0.05，k為實驗組數(shù)），得出P<0.003

7、13為差異有顯著性。
　　結(jié)果：
　　1、脊柱兩側(cè)毛發(fā)剃除干凈，未見傷痕及出血點，角質(zhì)層、顆粒層、棘層、基底層及真皮層層次分明，角質(zhì)層完好無損，皮膚屏障結(jié)構(gòu)健全；修剪后皮膚未見肉眼可見皮下組織及破洞，皮下面完整光滑，完整保留真皮層；微針陣列針刺皮膚后，作用部位角質(zhì)層破壞，刺入深度達真皮乳頭層。
　　2、HA體外透皮正交實驗中，針頭越粗、分子量越小、透皮時間越長，HA的透過量越多（P＜0.05）?！?8G-10k-7h”

8、、“18G-100k-5h”、“22G-10k-5h”、“22G-100k-7h”組合的透過量（ng·L-1）分別為410.555、231.700、294.705、215.440，考慮分子量越大，其降解速度越慢，效果越持久，分子量定為100kDa；當透皮時間在3～5h，其透皮速率最大，所以將透皮時間定為4h；而針頭型號在22G或18G中選擇，根據(jù)兩者的愈合過程擇優(yōu)而定。
　　3、肉眼觀：22G微針針刺后15h基本愈合，而18G延遲

9、到21h，兩種針型到24h基本恢復正常皮膚形態(tài)。因此，最優(yōu)體內(nèi)實驗組合確定為“22G-100k-4h”，選擇22G微針進行在體鈣黃綠素染色、創(chuàng)傷愈合組織學觀察和透明質(zhì)酸透皮實驗。
　　4、鈣黃綠素染色：22G微針針刺皮膚，經(jīng)過0h、3h、6h、9h、12h、15h的愈合過程后，行鈣黃綠素染色10min立即觀察，光斑個數(shù)小幅度減少，染色率分別為98.9％、97.8％、95.6％、94.4％、92.2％、91.1％，兩兩相比，染色率輕

10、度下降（P＞0.00313）；經(jīng)過18h、21h、24h的愈合過程后，光斑個數(shù)大幅度減少，染色率分別為3.3％、1.1％、2.2％，與0h相比，染色率大幅度降低（P＜0.00313）。隨著愈合時間的延長，熒光光斑輪廓逐漸變小，15h時微弱可見，18h已無熒光光斑。
　　5、創(chuàng)傷愈合組織學觀察：22G微針針刺后皮膚屏障破壞，深達真皮乳頭層，隨著愈合時間的延長，微孔收縮，尺寸變小。到18h，微孔被增生的表皮細胞覆蓋，皮膚屏障結(jié)構(gòu)基本恢

11、復。
　　6、HA皮膚滯留量：正常對照組（無微針預處理的正常皮膚外用HA）皮膚HA含量與空白對照組（無微針預處理的正常皮膚外用PBS液）相同（P＞0.05）。22G微針針刺，分別經(jīng)過0h、3h、6h、9h、12h、15h愈合后，再涂抹HA，皮膚內(nèi)HA的含量均高于空白對照組（P＜0.05），且隨著愈合時間點的增加，皮膚HA的含量減少（P＜0.01）；而經(jīng)過18h、21h、24h的愈合時間后，再給予HA，皮膚內(nèi)HA的含量與空白對照組相

12、近（P＞0.05）。
　　7、HA肉膜滯留量：22G針刺后分別經(jīng)過0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h愈合后，再給予外用HA，肉膜層HA的含量與空白對照組相近（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、微針所致皮膚創(chuàng)傷在24h內(nèi)愈合，皮膚屏障功能恢復。
　　2、22G微針針刺后HA（Mr=100kDa）的透皮量增加。隨著微創(chuàng)傷的愈合，其透過量逐漸減少，18h后，創(chuàng)傷愈合，皮膚屏障功能恢復，H