SH-SY5Y細(xì)胞α3尼古丁受體表達(dá)水平的改變對突觸相關(guān)蛋白的影響.pdf

1、目的：
　　研究人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)α3尼古丁受體(?3 nicotinic acetylcholine receptors,α3 nAChR)基因表達(dá)上調(diào)及下調(diào)后對細(xì)胞突觸相關(guān)蛋白及鈣信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響，從而探討α3 nAChR在阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)發(fā)病機(jī)制中的可能作用。
　　方法：
　　(1)采用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法獲取人α3 nAChR基因，用T4 DNA連接

2、酶將其連接到pcDNA3.1質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒α3 nAChR-pcDNA3.1，電泳鑒定插入片段大小，雙向測序鑒定插入堿基序列和方向；下調(diào)α3 nAChR水平選擇商品化的α3 nAChR shRNA Plasmid。(2)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，用Real-time PCR(qPCR)法和蛋白免疫印跡(Western Blot)法鑒定得到α3 nAChR基因上調(diào)及下調(diào)的SH-SY5Y細(xì)胞。(3)用qPCR和WB方法分別檢測SH-SY5Y細(xì)胞中突觸

3、素(synaptophysin，SYP)、突觸后膜蛋白(PSD-95)、銜接蛋白180(adaptor protein，AP180)、發(fā)動(dòng)蛋白1(dynamin1，DYN1)、鈣調(diào)蛋白(Calmodulin，CaM)、鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II(Calmodulin-binding protein kinase I I，CaMKI I)環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP responsive element-binding protei

4、n，CREB) mRNA和蛋白及磷酸化CREB(pCREB)蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：
　　(1)成功構(gòu)建了使?3 nAChR上調(diào)的重組質(zhì)粒?3 nAChR-pcDNA3.1。(2)將?3 nAChR-pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)到 SH-SY5Y細(xì)胞中后，與空載質(zhì)粒組及正常對照組相比，α3 nAChR mRNA及蛋白表達(dá)水平分別增加了418%和116%(P<0.01)；將α3 nAChR shRNA Plasmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

5、到 SH-SY5Y細(xì)胞中后，與空載質(zhì)粒組及正常對照組相比，α3 nAChR mRNA及蛋白表達(dá)水平分別降低了76%和67%(P<0.01)。(3)α3 nAChR上調(diào)組的突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD-95、AP180、DYN1、CaM、CaMKI I、CREB mRNA和蛋白及pCREB蛋白表達(dá)水平與對照組相比都有增加，而α3 nAChR下調(diào)組的突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD-95、DYN1、AP180、CaM、CaMKI I、CREB mR

6、NA和蛋白及 pCREB蛋白表達(dá)水平與對照組相比都有降低(P<0.01，P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　SH-SY5Y細(xì)胞α3 nAChR水平上調(diào)能夠提高突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD-95、AP180、DYN1及鈣信號(hào)通路相關(guān)蛋白CaM、CaMKI I、CREB mRNA和蛋白以及pCREB蛋白的表達(dá)水平，而SH-SY5Y細(xì)胞α3 nAChR水平下調(diào)能夠降低突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD-95、AP180、DYN1及鈣信號(hào)通路相