神經(jīng)型尼古丁受體α3亞單位沉默對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞β淀粉樣蛋白和凋亡的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院2011屆碩士研究生論文1神經(jīng)型尼古丁受體神經(jīng)型尼古丁受體α3亞單位亞單位沉默對(duì)沉默對(duì)SHSY5Y細(xì)胞細(xì)胞β淀粉樣蛋白和淀粉樣蛋白和凋亡的影響及其機(jī)制研究凋亡的影響及其機(jī)制研究生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究生：張雪玲導(dǎo)師：官志忠教授單可人教授摘要【目的】測(cè)定神經(jīng)型尼古丁受體(NeuronalnicotinicacetylcholinereceptnAChR)α3亞單位mRNA沉默后的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(Neuroblastomacel

2、lSHSY5Y)中β淀粉樣蛋白（?Amyloidpeptide，Aβ）含量、β分泌酶兩個(gè)亞型（Bace1和Bace2)mRNA和蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡水平、凋亡相關(guān)通路P38MAPK及凋亡相關(guān)分子（Bax、Bcl2）含量，研究α3nAChR亞單位在阿爾茨海默?。ˋlzheimer’sdisease，AD）發(fā)病中的神經(jīng)保護(hù)作用?！痉椒ā窟x用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α3nAChRsiRNA表達(dá)質(zhì)粒的SHSY5Y細(xì)胞、空質(zhì)粒對(duì)照細(xì)胞和正常對(duì)照組細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒

3、光定量PCR(RealtimePCR)和蛋白質(zhì)印跡方法（WesternBlotting）檢測(cè)α3nAChR亞單位mRNA和蛋白表達(dá)水平；用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)Aβ含量；用RealtimePCR和WesternBlotting方法檢測(cè)細(xì)胞中β分泌酶兩個(gè)亞型（Bace1和Bace2）mRNA和蛋白表達(dá)水平。用Aβ（10μmolL，48小時(shí)）處理α3nAChR亞單位mRNA沉默后的SHSY5Y細(xì)胞、空質(zhì)粒對(duì)照細(xì)胞和正

4、常對(duì)照組細(xì)胞，用AnnexinV–FITC凋亡檢測(cè)試劑盒，經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡水平；用WesternBlotting方法測(cè)定P38MAPK通路中P38蛋白表達(dá)水平；用ELISA方法檢測(cè)Bax、Bcl2含量?！窘Y(jié)果】與空質(zhì)粒對(duì)照組及正常對(duì)照組細(xì)胞相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α3nAChRsiRNA表達(dá)質(zhì)粒的SHSY5Y細(xì)胞中，α3nAChR亞單位mRNA及蛋白表達(dá)水平降低，A?含量增加，Bace1mRNA和蛋白表達(dá)水平增加，Bace2mRNA和蛋白

5、表達(dá)水平減少。用Aβ處理后，與空質(zhì)粒對(duì)照組及正常對(duì)照組細(xì)胞相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α3nAChRsiRNA表達(dá)質(zhì)粒的SHSY5Y細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡率增加，磷酸化P38蛋白表達(dá)量增加，而總P38蛋白表達(dá)水平未見(jiàn)明顯改變，Bax含量增加、Bcl2含量減少?！窘Y(jié)論】針對(duì)α3nAChR亞單位的小分子干擾RNA有效地抑制了培養(yǎng)細(xì)胞中α3nAChR亞單位mRNA和蛋白水平的表達(dá)；α3nAChR亞單位mRNA沉默可以增加貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院2011屆碩士研究生論文3前言阿

6、爾茨海默氏病(Alzheimer’sdisease，簡(jiǎn)稱(chēng)AD，又稱(chēng)老年性癡呆)，是一種主要在老年期發(fā)生的以智力緩慢性進(jìn)行性喪失為主要特征的神經(jīng)退變性疾病。AD已成為繼心臟病、癌癥、中風(fēng)后的第四位死亡原因。其主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、記憶力衰退、性格和行為改變等。在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家及我國(guó)，AD發(fā)病有增多的趨勢(shì)。一般年齡在65歲左右時(shí)，AD的發(fā)病率約為25%年齡75歲左右時(shí)，發(fā)病率約為10%，年齡到90歲時(shí)，AD發(fā)病率可高達(dá)3540%[

7、12]。病理學(xué)上以細(xì)胞外老年斑(SenileplaquesSPs)形成及神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NeurofibrillarytanglesNFTs)及神經(jīng)元丟失為主要特征[35]。老年斑的主要成分為?淀粉樣蛋白(?Amyloidpeptide，A?)，是一種神經(jīng)毒性物質(zhì)，可以引起神經(jīng)元的損傷和調(diào)亡，在AD的發(fā)病中起著重要的作用。A?是APP經(jīng)?及?分泌酶水解生成的3943個(gè)氨基酸多肽，其中的2535氨基酸殘基是神經(jīng)毒性必需結(jié)構(gòu)。β分

8、泌酶（BACE）是啟動(dòng)Aβ形成的關(guān)鍵限速酶。因此，BACE有望成為治療AD的作用靶點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)治療AD提供了一條新思路[6]。在AD的發(fā)病機(jī)制中膽堿能受體的改變引起了越來(lái)越多的重視，膽堿能受體包括尼古丁受體和毒蕈堿樣受體，尼古丁受體又分為神經(jīng)型和肌肉型。nAChR與大腦學(xué)習(xí)記憶、智力發(fā)育和識(shí)別能力等腦功能有關(guān)，還具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[7]，在阿爾茨海默病的發(fā)病中起著重要的作用。本課題組前期研究表明α3nAChR亞單位具有一定的神經(jīng)保護(hù)作

9、用，在AD的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[8]，但其具體機(jī)制我們并不清楚，其是否與β淀粉樣蛋白生成，及與其密切相關(guān)的β分泌酶有關(guān)，有待本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。本研究將細(xì)胞分為正常對(duì)照組(細(xì)胞未經(jīng)任何處理，無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒NegativecontrolpSilencer3.1H1neo的空質(zhì)粒對(duì)照組，轉(zhuǎn)染α3nAChRpSilencer3.1H1neo質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組，觀察α3nAChR亞單位對(duì)Aβ含量的影響及對(duì)β分泌酶兩個(gè)亞型（Bace1Bac