M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)物促進(jìn)雷公藤紅素致腫瘤細(xì)胞凋亡作用的研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中的重要組成成份，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，位于腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞通常被稱為“腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞”（Tumor-associated macrophages，TAMs）。近年來越來越多的研究表明，在不同的治療方法或腫瘤類型中，TAMs可起到增強(qiáng)或拮抗治療方法的效應(yīng)，也可在治療后驅(qū)動(dòng)機(jī)體修復(fù)起到一定作用。經(jīng)典活化途徑的巨噬細(xì)胞（ classically activ

2、ated macrophage）亦稱為M1型巨噬細(xì)胞，由Th1細(xì)胞因子（如干擾素γ）、外源性TNF-α或者內(nèi)源性TNF-α的誘導(dǎo)劑（如細(xì)菌代謝產(chǎn)物脂多糖等）誘導(dǎo)激活，并分泌多種炎癥因子（如IL-6、IL-12、IL-1、TNF-α）、趨化因子（如CCL2、CCL3）以及趨化因子配體（如 CXCL9、CXCL10）等。M1型巨噬細(xì)胞能夠殺傷腫瘤細(xì)胞、清除感染病原體，同時(shí)可作為一種有效的炎癥介質(zhì)，參與炎癥反應(yīng)。
　　雷公藤紅素（Cel

3、astrol，Cel）是一種天然化合物，具有抗炎、抗腫瘤及免疫抑制等多種藥理活性。Cel通過抑制AKT/mTOR/P70S6K通路的活化，抑制血管生成和腫瘤的生長(zhǎng)；也可通過調(diào)控生存信號(hào)通路，如Notch或NF-κB的活性抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；也有研究表明Cel是天然蛋白酶體抑制劑，通過抑制20S蛋白酶體的活性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
　　本研究利用細(xì)菌代謝產(chǎn)物脂多糖（Lipopolysaccharides

4、，LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，即M1型巨噬細(xì)胞，得到培養(yǎng)上清液，使用上清液（M1 macrophage products/LPS-stimulated macrophage products，LSMP）與Cel單獨(dú)或者共同作用于乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-231和前列腺癌細(xì)胞系 PC-3，并采用MTT、qRT-PCR以及Western blotting等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)LSMP對(duì)Cel導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡作用的影響及其潛在的作用機(jī)制。結(jié)果表明，LSM

5、P具有增強(qiáng)Cel致MDA-MB-231細(xì)胞和PC-3細(xì)胞凋亡的作用，此作用可能與caspase-3，8，9的激活以及NF-κB通路活化的抑制，進(jìn)而下調(diào)凋亡抑制蛋白XIAP和cIAP1/2的表達(dá)有關(guān)。這些結(jié)果說明，受不同刺激因素作用的巨噬細(xì)胞能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。巨噬細(xì)胞可能成為臨床抗腫瘤藥物效應(yīng)差異研究的新靶點(diǎn)。
　　研究方法:
　　1.不同濃度（10％、30%、50%、100%）的LSMP與Cel(1μM、1

6、.5μM)單獨(dú)或者共同作用于人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3，設(shè)立空白對(duì)照組，采用MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力進(jìn)行檢測(cè)。
　　2.不同濃度（0%、50%、100%）的LSMP與Cel(1.5μM)單獨(dú)或者共同作用于人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3，設(shè)立空白對(duì)照組，采用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。
　　3.不同濃度（30%、50%

7、、100%）的LSMP與Cel(1.5μM)單獨(dú)或者共同作用于人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和前列腺癌細(xì)胞株 PC-3，設(shè)立空白對(duì)照組，采用Western blotting對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)PARP、pro-caspase-3、pro-caspase-8、pro-caspase-9的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　4.不同濃度（30%、50%、100%）的LSMP與Cel(1.5μM)單獨(dú)或者共同作用于人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231

8、和前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3，設(shè)立空白對(duì)照組，采用Western blotting方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)泛素化蛋白（Ub-prs）、IκB和TNF-α的蛋白表達(dá)水平以及胞漿和胞核核轉(zhuǎn)錄因子κB P65（NF-κB-P65）的水平。
　　5.不同濃度（30%、50%、100%）的LSMP與Cel(1.5μM)單獨(dú)或者共同作用于人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3，設(shè)立空白對(duì)照組，采用Western blotting對(duì)不

9、同時(shí)間點(diǎn)的凋亡抑制蛋白XIAP和cIAP1/2的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　6.利用siRNA干擾NF-κB-P65基因的表達(dá)，采用qRT-PCR和Western blotting方法，檢測(cè)在LSMP（50%）與Cel(1.5μM)共同作用下NF-κB-P65、XIAP、cIAP1/2的基因和蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.與Cel單獨(dú)作用相比，LSMP與 Cel共同作用，可明顯增加兩種腫瘤細(xì)胞的凋亡率，抑制細(xì)胞的

10、增殖和遷移。
　　2.與Cel單獨(dú)作用相比，LSMP與Cel共同作用，可明顯促進(jìn)PARP、pro-caspase-3、pro-caspase-8、pro-caspase-9的降解。
　　3.與Cel單獨(dú)作用相比，LSMP與Cel共同作用下，蛋白酶體活性無顯著變化。
　　4.與Cel單獨(dú)作用相比，LSMP與Cel共同作用，可明顯抑制XIAP、cIAP1/2表達(dá)。
　　5.與Cel單獨(dú)作用相比，LSMP與Cel共同作

11、用下，可明顯抑制IκB的降解、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB-P65的核轉(zhuǎn)位及NF-κB信號(hào)通路的活化，同時(shí)降低TNF-α的蛋白表達(dá)量。
　　6.與 LSMP+Vector siRNA作用組相比，LSMP與Cel共同作用，可明顯抑制NF-κB-P65、XIAP、cIAP1/2 mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)
　　結(jié)論：
　　研究結(jié)果表明：LSMP可增強(qiáng)Cel對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3增殖、存活和遷