雷公藤內(nèi)酯醇對大鼠卵泡細胞凋亡的影響.pdf

1、研究背景： 雷公藤內(nèi)酯醇(Triptolide，TR)，又稱雷公藤內(nèi)酯、雷公藤甲素、PG490，是從衛(wèi)矛科雷公藤屬植物中成功分離提純出的環(huán)氧二萜化合物。當前研究發(fā)現(xiàn)TR具有抗炎、抗腫瘤、免疫抑制、抗生育作用等多種生物活性!進一步對該藥的探索發(fā)現(xiàn)TR發(fā)揮生物活性的主要作用機制是誘導細胞凋亡；在婦產(chǎn)科領(lǐng)域，多年來一直將雷公藤提取出的混合制劑“雷公藤多甙”在內(nèi)科使用中出現(xiàn)的女性閉經(jīng)與不孕這一性腺抑制現(xiàn)象歸為毒副作用，回避多于探索。直至

2、近期，國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)在婦科子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤等患者中使用雷公藤提取物得到良好治療效果，使人們開始認識到雷公藤內(nèi)酯醇作為雌激素拮抗劑和免疫調(diào)節(jié)劑可推廣使用到婦科臨床并治療上述雌激素依賴性疾病。但是TR對女性生殖系統(tǒng)，尤其是對卵巢卵泡發(fā)育的影響及其作用機制尚未闡明。TR對女性性腺活動抑制的程度及其是否導致卵巢生殖潛能永久性損害等重要問題亟待研究。 研究目的： 通過動物體內(nèi)實驗，研究不同劑量TR處理后大鼠動情周期和卵巢組織

3、學的改變，客觀計數(shù)各級卵泡數(shù)目變化和卵泡凋亡率，探討TR的卵巢抑制機制；并且設置停藥恢復觀察組，進一步研究藥物作用的可逆性。 方法： 選取性成熟、有規(guī)律動情周期的健康雌性SD大鼠60只，隨機分為以下6組(每組10只)：空白對照組無用藥處理；安慰劑對照組每日給予蒸餾水灌胃(含0.06％溶媒二甲基亞砜)；TR高劑量組、TR低劑量組每日分別灌喂120 μg／kg／d、60 μ g／kg／d的TR(0.06％二甲基亞砜溶解后配制

4、)；以上各組處理期共35天；另外設立高、低劑量停藥恢復組，此2組大鼠分別給予前述35天TR高、低劑量灌胃處理后，繼續(xù)停藥飼養(yǎng)30天，觀察處理期后有無藥物延遲作用以及藥物的影響能否恢復。整個觀察期間，各組大鼠每日陰道涂片觀察動情周期；每隔4天測量體重以調(diào)整用藥劑量并觀察動物生長情況。觀察期末，麻醉手術(shù)、活體取材大鼠左側(cè)卵巢后處死動物，卵巢即刻固定，石蠟包埋后連續(xù)切片進行組織學研究，分類計數(shù)各組大鼠卵巢切片中原始卵泡、次級卵泡、竇卵泡的數(shù)目

5、進行組間比較；并用TUNEL(脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的DNA缺口末端標記)法對卵巢切片中的凋亡細胞進行原位標記，顯微鏡下辨認標記的凋亡卵泡(出現(xiàn)卵母細胞凋亡著色或10％以上的顆粒細胞凋亡著色的卵泡)，也按原始卵泡、次級卵泡、竇卵泡三個不同發(fā)育階段分類計數(shù)。 結(jié)果： 1.TR作用下大鼠生長狀況未受影響 實驗全程大鼠基本生活狀態(tài)良好，未出現(xiàn)病、死現(xiàn)象；處理前、后各組大鼠體重差異無統(tǒng)計學意義；與對照組相比，本研究

6、未發(fā)現(xiàn)TR處理后大鼠生長受限。2.TR作用下大鼠動情周期發(fā)生改變高劑量組大鼠出現(xiàn)明顯的動情周期延長(動情周期平均5.674±1.45天)，與低劑量組、安慰劑對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.001、<0.001)；而且此組大鼠中44.5％的個體出現(xiàn)過動情周期缺失，而其它各組僅有不到18％的個體會出現(xiàn)這種比較明顯的動情周期停滯現(xiàn)象；但停藥觀察期，高劑量停藥恢復組大鼠的動情周期平均水平較用藥期顯著下降(4.174±0.59)，停藥

7、前后相比差異有統(tǒng)計學意義(p=0.010)，而且該組停藥期動情周期長短與對照組相比差異則無統(tǒng)計學意義，結(jié)果顯示恢復期該組大鼠動情周期回復到正常水平。低劑量組大鼠動情周期則未受明顯抑制，其動情周期長短與對照組相比無統(tǒng)計學差異。 3.組織形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)TR處理組大鼠卵巢中次級卵泡分布改變 高劑量組和低劑量組大鼠卵巢內(nèi)次級卵泡的計數(shù)較對照組均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；而各組間原始卵泡和竇卵泡計數(shù)的差異則無統(tǒng)計

8、學意義；進一步比較高、低劑量組間次級卵泡的計數(shù)水平雖無統(tǒng)計學差異，然而從所得數(shù)值看出，低劑量組次級卵泡均數(shù)(13.9±2.33)要略高于高劑量組(12.0±1.55)；高、低劑量停藥恢復組各階段的卵泡計數(shù)則與對照組相比無統(tǒng)計學差異。除此以外，各組大鼠卵巢組織形態(tài)學研究未發(fā)現(xiàn)卵巢壞死、變性等受損表現(xiàn)。 4.TR處理組大鼠卵巢中次級卵泡凋亡率明顯增高 高劑量組和低劑量組大鼠均出現(xiàn)次級卵泡凋亡率的明顯增加，分別為：31％、3

9、2％，與安慰劑和空白對照組(凋亡率分別為12％、13％)相比差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.01)；而各組間原始卵泡和竇卵泡凋亡率的差異無統(tǒng)計學意義。經(jīng)過停藥恢復期，低劑量停藥恢復組大鼠卵巢內(nèi)次級卵泡的凋亡率(21％)與低劑量處理組的凋亡率(32％)相比顯著降低(p=0.043)，而與對照組相比則凋亡率無統(tǒng)計學差異；高劑量停藥恢復組的次級卵泡凋亡率為26％，與高劑量處理組的凋亡率(31％)相比差異尚無統(tǒng)計學意義； 結(jié)果顯示：不同劑量

10、的TR都可促進卵巢內(nèi)次級卵泡細胞的凋亡，導致次級卵泡發(fā)育停滯而在卵巢中堆積，但尚未出現(xiàn)大量卵泡耗竭。低劑量組停藥后這種改變能很快恢復；而高劑量TR對卵巢抑制和誘導次級卵泡凋亡的作用似乎更強，經(jīng)過停藥觀察期，高劑量恢復組動情周期長短已恢復到對照組水平，但次級卵泡凋亡率雖呈現(xiàn)下降趨勢卻未完全恢復。 結(jié)論： 1.雷公藤內(nèi)酯醇抑制雌性大鼠卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育并導致動情周期延長；這種抑制的主要環(huán)節(jié)在于TR可通過誘導大鼠卵巢內(nèi)次級卵泡細胞