NaCl對(duì)M1型巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究高鹽對(duì)M1型巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控，并在內(nèi)毒素休克炎癥疾病模型中得到驗(yàn)證，這為臨床一些疾病的干預(yù)和治療提供了理論依據(jù)，同時(shí)為我們下一步探究其機(jī)制打好堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　方法：⑴用GM-CSF誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源的原代巨噬細(xì)胞(BMDMs)，在加入LPS（200 ng/ml）和IFN-γ(10 ng/ml)之前，用不同濃度的NaCl預(yù)處理BMDMs2小時(shí)。用CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力的方法檢測(cè)不同濃度的NaCl對(duì)M1型巨噬細(xì)胞的活力的影響

2、，確定一個(gè)合適的高鹽濃度用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。用該合適的高鹽濃度預(yù)處理BMDMs，分別在處理后的6、12和24h收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞因子IL-6和IL-12p40的表達(dá)。用不同濃度的NaCl(5、10和20 mM)預(yù)處理BMDMs，24小時(shí)后，收取細(xì)胞并提取總RNA，RT-PCR檢測(cè)IL-6和IL-12p40在mRNA水平的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)抗體IL-12p40的平均熒光強(qiáng)度。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞表面

3、標(biāo)記CD86和MHCⅡ的表達(dá)。Western Blot檢測(cè)IRF5蛋白的表達(dá)。⑵成功誘導(dǎo)BMDMs，將細(xì)胞分為兩組，其中一組用NaCl預(yù)處理6小時(shí)，另外一組細(xì)胞不做任何處理，收取細(xì)胞，使其濃度為1×107/ml。將20只老鼠分為兩組，每組10只，分別將200μl上述兩組細(xì)胞腹腔注射入小鼠體內(nèi)。24小時(shí)后，每只小鼠腹腔注射800μg的LPS，觀察小鼠死亡率。24小時(shí)后，每只小鼠腹腔注射200μg的LPS，12小時(shí)后小鼠眼球取血，斷頸處死小

4、鼠，抽取腹腔細(xì)胞，獲得小鼠肺、肝臟和脾。病理切片H&E染色顯示小鼠肺和肝臟的損傷情況。ELISA檢測(cè)小鼠血清中IL-6和IL-12p40的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)小鼠腹腔和脾細(xì)胞中IL-6和IL-12p40在mRNA水平的表達(dá)。
　　結(jié)果：①高濃度的NaCl(≥40 mM)減弱了M1型巨噬細(xì)胞的活力。合適的高鹽濃度為20mM，該濃度不會(huì)隨著時(shí)間的增加影響細(xì)胞活力。②ELISA結(jié)果顯示，NaCl預(yù)處理后，IL-6和IL-12p40的表

5、達(dá)顯著降低，并且具有時(shí)間和劑量的依賴性。③RT-PCR顯示，與對(duì)照組相比，NaCl預(yù)處理組IL-6和IL-12p40的表達(dá)明顯降低了，且具有劑量依賴性。④流式細(xì)胞術(shù)顯示，相對(duì)于正常組，NaCl預(yù)處理組IL-12p40的表達(dá)也顯著減少。⑤流式細(xì)胞術(shù)顯示，與正常組相比，NaCl預(yù)處理組M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記CD86和MHCⅡ的表達(dá)并沒(méi)有明顯的變化。⑥Western Blot顯示，與對(duì)照組相比，NaCl預(yù)處理組IRF5的表達(dá)也顯著減少。⑦注射

6、NaCl預(yù)處理的BMDMs組小鼠的死亡率明顯降低。⑧H&E染色顯示，NaCl干預(yù)可明顯抑制LPS所致的肺和肝臟組織的損傷。⑨注射NaCl預(yù)處理的BMDMs小鼠體內(nèi)，LPS所致的M1型巨噬細(xì)胞的極化明顯減少，其M1型巨噬細(xì)胞因子IL-6和IL-12p40的表達(dá)顯著減少。
　　結(jié)論：⑴NaCl可抑制體外M1型巨噬細(xì)胞的極化，其細(xì)胞因子IL-6和IL-12p40的表達(dá)顯著降低，其機(jī)制可能是NaCl減少了M1型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子IRF5的