加味四逆湯對急性免疫性肝損傷小鼠的保護(hù)作用及部分機(jī)制研究.pdf

1、目的及意義:
　　肝損傷是臨床常見的危害人類健康的疾病，它是多種肝臟疾病共同存在的病理生理過程，對其進(jìn)行早期防治，可以預(yù)防肝臟纖維化、肝硬化、甚至肝臟腫瘤的產(chǎn)生。而目前對肝損傷的機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)許多中藥具有保護(hù)肝細(xì)胞膜穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、改善肝臟血液循環(huán)等功能，因此我們希望通過實(shí)驗(yàn)研究能夠發(fā)現(xiàn)治療肝炎及其并發(fā)癥的一種新的藥物方案。
　　四逆湯（si n i decoction, SND)出自《傷寒論

2、》，治少陰、四肢厥逆、急性虛脫證。大量藥理研究報(bào)道SND具有較強(qiáng)的清除自由基、抗氧化、改善微循環(huán)、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種藥理作用。本課題組主要利用其免疫調(diào)節(jié)作用，觀察此作用是否能阻止急性炎癥是我們探索的重點(diǎn)。
　　因此，依據(jù)導(dǎo)師的臨床經(jīng)驗(yàn)，本課題在原方基礎(chǔ)上加入具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗衰老功效的山茱萸組成以抗炎、免疫調(diào)節(jié)為主的加味四逆湯。近年來，刀豆蛋白A(Con A)復(fù)制的由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型被認(rèn)為是肝炎機(jī)制研究和新

3、藥篩選的可靠動物模型，據(jù)此本實(shí)驗(yàn)采用刀豆蛋白A建立了急性免疫性肝損傷動物模型，利用酶聯(lián)免疫法、免疫組化、Flow Cytometry等技術(shù)對加味四逆湯抗肝損傷作用和機(jī)制進(jìn)行初步探討，為臨床用藥提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　將健康雌性NIH小鼠50只，隨機(jī)分為5組:正常對照組，Con A模型組，聯(lián)苯雙酯組，加味四逆湯大、小劑量組。所有的小鼠均尾靜脈注射刀豆蛋白A（18mg.kg-1）來建立急性免疫性肝損傷動物模型，在造

4、模成功后摘取小鼠眼球采血，用酶聯(lián)免疫法檢測小鼠血清中門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的含量以及血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的活性，并取小鼠部分肝臟組織運(yùn)用嗜伊紅（HE）染色觀察肝組織病理學(xué)形態(tài)，免疫組化法觀察肝臟組織Fas抗原的表達(dá)。最后我們運(yùn)用了流式細(xì)胞技術(shù)定量檢測各組小鼠循環(huán)血液中CD4+、8+T淋巴細(xì)胞亞群的比例及活化狀態(tài)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)各組間效果的比較用單因素方差分析，數(shù)據(jù)

5、的統(tǒng)計(jì)出來用 SPSS13.0軟件處理，P＜0.05為有意義。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠一般情況的觀察：
　　正常對照組小鼠精神活動狀態(tài)良好，毛發(fā)光滑無明顯減少，飲食及大小便情況如舊；Con A模型動物組表現(xiàn)為毛發(fā)減少、行動遲緩，精神萎靡、蜷臥、乏力、納差、尿液發(fā)黃、大便溏泄。而陽性藥物組及加味四逆湯大、小劑量組部分小鼠亦出現(xiàn)上述癥狀及體征，但出現(xiàn)時(shí)間較模型組延遲，且隨藥物劑量的增加，上述癥狀和體征逐漸減輕。
　

6、　2.加味四逆湯對Con A免疫性肝損傷小鼠的保護(hù)作用
　　小鼠尾靜脈注射Con A造模后，模型組血清轉(zhuǎn)氨酶ALT及AST活性水平升高，解剖小鼠肉眼觀察模型組小鼠肝臟體積增大，被膜腫脹，邊緣變鈍，呈暗紅色，表面可見點(diǎn)狀及片狀的出血壞死點(diǎn)，脾臟也有明顯淤血腫大。模型組小鼠肝臟指數(shù)明顯高于生理鹽水對照組，且差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。光鏡下可見正常組小鼠整個(gè)肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝臟細(xì)胞基本無氣球樣變性和病理性壞死、凋亡，肝臟內(nèi)

7、無炎癥細(xì)胞浸潤。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)大部分被破壞，在肝組織中央可見大量的碎片狀壞死和或氣球樣變性，此外還有許多嗜伊紅類圓形的凋亡肝細(xì)胞存在，并可見大量肝枯否細(xì)胞增生和炎癥淋巴細(xì)胞的浸潤;而各藥物組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)基本存在，肝細(xì)胞病理性壞死和炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少。以上結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)小鼠在注射Con A后，誘導(dǎo)了明顯的肝損傷。而加味四逆湯大、小劑量組均有減輕血清轉(zhuǎn)氨酶活性水平，抑制炎性細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子的分泌，并減輕肝臟細(xì)胞的病理性壞死和凋亡，對

8、Con A誘導(dǎo)的肝臟損傷程度具有一定的治療作用，且成明顯的量效關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為加味四逆湯抗免疫性肝損傷作用提供了動物實(shí)驗(yàn)依據(jù)，在接下來的工作中我們會對其作用機(jī)制作進(jìn)一步的研究。
　　3.加味四逆湯對肝損傷小鼠循環(huán)血中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的作用
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明與正常組比較，各模型組小鼠循環(huán)血液中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比率有明顯減低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較，藥物組小鼠循環(huán)血中CD4+

9、、CD8+淋巴細(xì)胞的升高率也具有明顯差異(P<0.05），此結(jié)果表明加味四逆湯通過升高急性免疫性肝損傷中小鼠循環(huán)血液中CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞比率,降低淋巴細(xì)胞在肝臟內(nèi)的數(shù)目，從而減少其肝臟的炎癥破壞作用。3.4加味四逆湯對肝損傷小鼠細(xì)胞凋亡的影響
　　結(jié)果表明模型組血清中TNF-α含量進(jìn)行性升高，與對照組、藥物組比較均有差異（P<0.05）。模型組 Fas抗原大量表達(dá)在肝細(xì)胞膜上，尤其是在碎屑樣壞死和或橋接樣壞死周圍淋巴細(xì)胞浸

10、潤區(qū)域的肝細(xì)胞膜上表達(dá)明顯。對照組和藥物組血清中TNF-α水平變化不大，肝細(xì)胞F as抗原表達(dá)不明顯。據(jù)上說明加味四逆湯能夠干預(yù)Con A小鼠肝臟組織F as抗原和血清TNF-α水平的表達(dá)，對急性肝損傷的細(xì)胞凋亡有較好的保護(hù)作用。
　　結(jié)論:
　　加味四逆湯通過活化外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞的含量及其活性，減少細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞向肝臟內(nèi)浸潤；抑制小鼠血清腫瘤壞死因子水平和肝細(xì)胞 Fas抗原的表達(dá)，從而阻斷肝細(xì)胞病理性壞